任建東,施用暉1,,樂(lè)國(guó)偉1,＊,馬立芹,尹曉平,姜 紅

1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2江南大學(xué)食品學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究所,無(wú)錫 214122

鹿茸血肽疏水性分離及抗氧化和ACE抑制作用的研究

任建東2,施用暉1,2,樂(lè)國(guó)偉1,2＊,馬立芹2,尹曉平2,姜 紅2

1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2江南大學(xué)食品學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究所,無(wú)錫 214122

實(shí)驗(yàn)采用DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì) Alcalase蛋白酶水解鹿茸血 3 h的水解液進(jìn)行吸附,采用 25%、50%、75%、100%乙醇分級(jí)洗脫,收集各組分進(jìn)行氨基酸組成分析,發(fā)現(xiàn)各洗脫組分具有不同疏水性值,同時(shí)測(cè)定各組分的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性和二苯代苦味肼基自由基 (DPPH·)清除活性:75%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性最高,為 54.71%,且ACE抑制活性與組分疏水性值顯著相關(guān);100%乙醇洗脫組分的 DPPH ˙清除率最高。

鹿茸血;大孔吸附樹(shù)脂;疏水性;ACE抑制活性;DPPH自由基

大孔樹(shù)脂分離純化技術(shù)是 20世紀(jì) 60年代末發(fā)展起來(lái)的一類新型非離子型高分子吸附劑,具有分離條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、容易再生等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于環(huán)保、化工、醫(yī)藥等行業(yè)。關(guān)于大孔吸附樹(shù)脂用于制藥及天然植物中活性成分如皂苷、黃酮、內(nèi)脂、生物堿等大分子化合物的提取分離已有大量報(bào)道[1],而近年來(lái)程云輝[2]、鐘芳[3]、過(guò)振宇[4]、Cheison[5]等利用大孔吸附樹(shù)脂分級(jí)純化大豆肽、麥胚肽、家蠅抗菌肽、乳清蛋白水解物,得到不同生物活性的組分,將大孔吸附樹(shù)脂的應(yīng)用拓展到新的領(lǐng)域。

大孔吸附樹(shù)脂主要通過(guò)分子間作用力如范德華力或氫鍵等對(duì)溶液中的分子進(jìn)行吸附,吸附劑表面的親水性或者疏水性決定了其具有不同的吸附特性;同時(shí)本身的多孔性結(jié)構(gòu)亦決定了其具有一定的分子篩作用。因此根據(jù)大孔樹(shù)脂的極性、孔徑等吸附特性,配合不同極性的洗脫劑洗脫,可以分離純化得到不同極性,即不同疏水性的組分[2-5],這對(duì)于生物活性肽的分離制備具有重要意義,因?yàn)槟壳耙阎蟛糠侄嚯牡纳锘钚跃c疏水性氨基酸密切相關(guān)[5]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用具有多種生物活性的鹿茸血[7]酶解物經(jīng)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂,以乙醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫,計(jì)算各組分疏水性值并研究其與抗氧化和ACE抑制活性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鹿茸血 (新疆特豐藥業(yè)集團(tuán));Alcalase FG 2.4L (Novo公司);DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂 (江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司);ACE(sigma公司); Multiskan MK3酶標(biāo)儀 (美國(guó) Thermo公司);Agilent1100型氨基酸自動(dòng)分析儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 鹿茸血肽的制備

在鹿茸血中加入適量蒸餾水,配制成 50 mg/mL底物,于沸水浴加熱 10 min,冷卻至 60℃,用 2 mol/ L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值等于 9.0,按照 30μL/g底物蛋白的比例加入 Alcalase蛋白酶酶液進(jìn)行反應(yīng), Alcalase蛋白酶活力為 1.10×104U/mL。不斷滴加2 mol/L NaOH溶液維持 pH值穩(wěn)定。水解過(guò)程在酶解器中進(jìn)行,保持溫度穩(wěn)定在 60℃。3 h后停止反應(yīng),沸水浴 10 min后迅速冷卻滅酶,4000 rpm離心20 min取上清液備用。最終水解度為 13.80%。

1.3 DA201-C大孔樹(shù)脂分級(jí)洗脫上樣濃度和流速的確定

將一定量的樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡 24 h,然后用無(wú)水乙醇洗至 220 nm無(wú)吸收峰,再用去離子水洗凈,裝滿 2.6 cm×30 cm的層析柱。

不同流速對(duì) DA201-C大孔樹(shù)脂吸附性能的影響:室溫條件下,用濃度為 10 mg/mL的水解液以0.5、1、2 BV/h的速度流經(jīng)層析柱,用紫外檢測(cè)器檢測(cè)流出液的A220 nm,以A220 nm=0.05為穿透點(diǎn),比較不同流速時(shí)的穿透體積。

不同濃度對(duì)DA201-C大孔樹(shù)脂吸附性能的影響:用濃度為 10、30、50 mg/mL的水解液以 0.5 BV/ h的速度流經(jīng)層析柱,用紫外檢測(cè)器檢測(cè)流出液的A220 nm,以A220 nm=0.05為穿透點(diǎn),比較不同流速時(shí)的穿透體積。

1.4 鹿茸血肽的大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)乙醇分級(jí)洗脫

室溫條件下,用濃度為 50 mg/mL的鹿茸血肽以0.5 BV/h的流速流經(jīng)層析柱,用紫外檢測(cè)器檢測(cè)流出液的A220 nm,以A220 nm=0.05為穿透點(diǎn),停止上樣。用去離子水洗去未吸附的物質(zhì),之后分別用25%、50%、75%、100%的乙醇以 2 BV/h的流速流經(jīng)層析柱,當(dāng) A220 nm吸光值小于 0.05的時(shí)候停止洗脫。收集各洗脫峰。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥,測(cè)定各組分的ACE抑制活性及DPPH·清除活性。

1.5 DPPH·清除活性的測(cè)定

取樣品 0.4 mL,加入 1×10-4mol/L DPPH·無(wú)水乙醇 2.8 mL混勻,避光反應(yīng) 20 min,4000 rpm離心 10 min,取上清夜在 517 nm測(cè)吸光度,樣品的吸光度為Ai;空白組用等體積的無(wú)水乙醇代替 DPPH ·無(wú)水乙醇溶液,吸光度為 Aj;對(duì)照組用等體積的蒸餾水代替樣品,吸光度為Ao。

1.6 ACE抑制率的測(cè)定

采用 Guang-Hong L等[8]人的馬尿酸直接比色法。

1.7 氨基酸組成分析

氨基酸自動(dòng)分析儀法,按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。

1.8 蛋白質(zhì)或多肽疏水值的計(jì)算[9]

式中:AAi為 100 g蛋白質(zhì)中各種氨基酸的含量(g);M i為各種氨基酸的摩爾質(zhì)量 (g/mol);ΣAAi/ M i為 100 g蛋白質(zhì)中氨基酸的總摩爾數(shù) (mol);Δfti為氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷灾?(kJ/mol);ΔQ為蛋白質(zhì)的疏水性值。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

將分級(jí)洗脫各組分的疏水性值,抗氧化和ACE抑制活性輸入 SPSS10.0軟件,分別對(duì)疏水性值與DPPH·清除率,以及疏水性值與 ACE抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DA201-C大孔樹(shù)脂分級(jí)洗脫上樣濃度和流速的確定

本實(shí)驗(yàn)采用的 DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂是一種比表面積較大的非極性吸附樹(shù)脂,在多肽的分離中應(yīng)用較為廣泛[2-4,9]。實(shí)驗(yàn)首先討論了上樣流速和濃度對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響,結(jié)果見(jiàn)表 1和 2。

表 1 不同流速的穿透點(diǎn)通液量Table 1 Volume of brokethrough point at different flow rates

表 2 不同濃度的穿透點(diǎn)通量Table 2 Volume of brokethrough point at different concentrations

對(duì)同一濃度的上樣溶液,若吸附流速過(guò)大,被吸附物質(zhì)來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面就提早泄露,而造成樣品的流失,樹(shù)脂的吸附量就會(huì)下降;但吸附流速過(guò)小,吸附時(shí)間就會(huì)延長(zhǎng)。確定最佳的吸附流速通常應(yīng)綜合考慮樹(shù)脂的吸附效果和工作效率。由表1可看出,隨著上樣流速由 0.5 BV/h提高到 2 BV/ h,通液量明顯降低,樹(shù)脂的吸附量也會(huì)隨之降低,故本試驗(yàn)確定 0.5 BV/h為上樣流速。表 2結(jié)果顯示,大孔吸附樹(shù)脂的穿透點(diǎn)通液量隨著被吸附物的濃度提高而增大,在不超過(guò)大孔樹(shù)脂吸附容量的情況下,可以適當(dāng)提高上樣濃度來(lái)增大動(dòng)態(tài)吸附量。本試驗(yàn)中,選擇 50 mg/mL濃度上樣。

2.2 DA201-C大孔吸附樹(shù)脂分級(jí)洗脫及活性測(cè)定

蛋白的酶解使得原先埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露出來(lái),從而使酶解得到的多肽可以從水相通過(guò)疏水相互作用吸附到樹(shù)脂的疏水表面。不同濃度的乙醇疏水性不同,與不同疏水性的肽段親和力也就不同,因此可利用不同極性的洗脫劑對(duì)多肽按照疏水性進(jìn)行分級(jí)純化,這對(duì)生物活性肽的分離制備具有重要意義,因?yàn)橐阎蟛糠稚锘钚噪牡幕钚远寂c疏水性氨基酸有關(guān)。如對(duì)于ACE抑制肽,疏水性氨基酸殘基占 60%以上,且 C末端的氨基酸為芳香族或疏水性氨基酸殘基的多肽具有更強(qiáng)的抑制活性[11]。程云輝[2]用 DA201-C型大孔樹(shù)脂對(duì)麥胚肽進(jìn)行分級(jí)洗脫,鐘芳[3]用DA201-C型大孔樹(shù)脂對(duì)大豆肽進(jìn)行分級(jí)洗脫,均得到不同疏水性和不同生物活性的肽段。

本實(shí)驗(yàn)在濃度 50 mg/mL、0.5 BV/h條件下上樣,用水洗去未吸附的物質(zhì),后依次采用 25%、50%、75%和 100%的乙醇作為洗脫劑,對(duì)鹿茸血肽進(jìn)行分級(jí)洗脫,分別收集各組分并測(cè)其得率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 不同濃度乙醇洗脫組分的得率Table 3 Percentages of different concentrations of ethanol delute fractions

從表 3中數(shù)據(jù)可以看出,大部分多肽在 25%和50%的乙醇濃度下被洗脫,這說(shuō)明大孔樹(shù)脂和鹿茸血肽之間的疏水性吸附較弱,很容易便被低濃度的乙醇洗脫下來(lái)。隨著乙醇濃度增大,被洗脫的多肽含量顯著下降。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度乙醇洗脫組分進(jìn)行了氨基酸組成分析,并計(jì)算了各組分的疏水性值,結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 水解液及梯度洗脫各組分的氨基酸組成 (g/100 g蛋白)Table 4 Amino acid compositions of hydrolysate and ethanol delute fractions(g/100 g protein)

注:未包含色氨酸含量,氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷祦?lái)源于文獻(xiàn)[9]Note:The contentwithout tryptophan,the value of hydrophobicity refer to reference 9

由表 4分析結(jié)果可知,隨著洗脫劑濃度提高,洗脫組分的疏水值也在升高,75%乙醇洗脫組分具有最高的疏水值為 5.63 kJ/mol、100%乙醇洗脫組分的疏水值雖稍有降低,但相對(duì)于乙醇濃度較低的幾個(gè)組分,仍保持在一個(gè)較高水平上。與未分離的鹿茸血肽相比,側(cè)鏈?zhǔn)杷?10以上的氨基酸含量均有明顯提高。

按照設(shè)想,100%乙醇疏水性最強(qiáng),其洗脫組分應(yīng)具有最高的疏水值,但實(shí)際 100%乙醇洗脫得到的組分疏水值為 5.59 kJ/mol,略低于 75%乙醇洗脫組分的疏水值。其原因可能為某些疏水性多肽在無(wú)水乙醇中的溶解性降低,以致其疏水值降低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[2],75%乙醇解吸效果好于 95%乙醇,這說(shuō)明某些肽段無(wú)法溶解于高濃度的乙醇,其疏水值有可能降低。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了各洗脫組分的ACE抑制活性,抗氧化活性及其與肽段疏水性的關(guān)系。各洗脫組分的ACE抑制活性和DPPH·清除活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖 1、2(測(cè)定活性時(shí)樣品濃度均為 0.2 mg/ mL),疏水性值與ACE抑制活性和抗氧化活性的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表 5。由圖 1、2和表 5結(jié)果可知,相對(duì)于分離前的水解液,各組分ACE抑制活性和抗氧化活性均有較大提高;ACE抑制活性與肽段疏水性值存在顯著相關(guān)性,ACE抑制率隨著肽段疏水性的升高而升高,75%乙醇洗脫得到的肽段具有最高的ACE抑制率,為 54.71%,但 100%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性卻稍有降低,這與鐘芳[3]的研究結(jié)果一致;而肽段疏水性值與DPPH˙清除率之間并無(wú)顯著相關(guān),DPPH˙清除率隨洗脫劑濃度的升高而一直升高,100%乙醇洗脫組分具有最高清除率,為9.84%。

表 5 疏水性值與ACE抑制活性和抗氧化活性的關(guān)系Table 5 The relationship between hydrophobicity and ACE inhibitory activity and antioxidative activity

3 結(jié)論

綜上所述,實(shí)驗(yàn)采用DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)鹿茸血肽進(jìn)行分級(jí)洗脫,氨基酸組成和疏水性值計(jì)算結(jié)果說(shuō)明大孔樹(shù)脂可按疏水性不同對(duì)蛋白或多肽進(jìn)行分離。同時(shí)測(cè)定 ACE抑制活性和抗氧化活性,結(jié)果顯示各組分疏水性值與ACE抑制活性顯著相關(guān)。大孔吸附樹(shù)脂可作為對(duì)生物活性肽進(jìn)行初步分離的簡(jiǎn)單有效手段。

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Study on the Hydrophobic Separation,ACE Inhibitory Activity and Antioxidative Activity of Red Deer Antler Blood Hydrolysate Peptides

REN Jian-dong2,SH I Yong-hui1,2,LE Guo-wei1,2＊,MA Li-qin2,Y IN Xiao-ping2,J IANG Hong21State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University;2Institute of Nutrition and Food Safety,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122,China

Red deer antler blood hydrolysateswere prepared by enzymatic hydrolysiswith Alcalase for 3 h.Macroporous adsorption resin were used for the fractionation of hydrophobic peptides from the hydrolysates by gradient ethanol elution.Amino acid analysis results suggested that different ethanol elution fractions have different hydrophobicities.75% ethanol fraction showed the highest inhibitory activityof angiotensin I-converting enzyme(ACE),and theACE inhibitory activity has a significant correlation with hydrophobicity.While 100%ethanol delute fraction has the highest DPPH· clearance rate.

red deer antler blood;macroporous adsorption resin;hydrophobic;ACE inhibitory activity;DPPH·

1001-6880(2010)02-0302-05

2008-03-31 接受日期:2008-08-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30571347);863項(xiàng)目(2007AA10Z325)

＊通訊作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn

Q516;S825

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