張祝蘭,唐文力,楊煌建,王 娟,洪金基

福建省微生物研究所,福州 350007

N-CWS灌胃對(duì)小鼠移植性腫瘤及免疫功能的影響

張祝蘭＊,唐文力,楊煌建,王 娟,洪金基

福建省微生物研究所,福州 350007

為了考察紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架(Nocardia rubracellwall skeleton,N-CWS)灌胃給藥對(duì)小鼠的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)及其免疫調(diào)節(jié)作用,采用小鼠肉瘤 S180的移植性腫瘤模型,檢測(cè) N-CWS灌胃給藥的抑瘤活性;同時(shí)觀察N-CWS體內(nèi)細(xì)胞毒作用和對(duì)正常小鼠的毒性、免疫器官重量、巨噬細(xì)胞 (MΦ)吞噬功能及脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果顯示,小鼠灌服N-CWS的 LD50>1.2 g/kg;N-CWS 200、400、800 mg/kg劑量灌胃小鼠對(duì) S180有明顯的抑制作用,其抑瘤率分別為 63.33%、71.11%、64.88%;與對(duì)照組比較,N-CWS可增加免疫器官重量和提升外周血白細(xì)胞數(shù)量、能明顯提高小鼠MΦ的吞噬活性及顯著提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P<0.05),同時(shí)N-CWS激活了的MΦ對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)亦明顯增強(qiáng)(P<0.05)。因此N-CWS適用于口服給藥,對(duì)小鼠移植性腫瘤有明顯的抑制作用,其抗腫瘤作用可能與增強(qiáng)機(jī)體免疫功能有關(guān)。

紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架;抗腫瘤;免疫調(diào)節(jié);給藥途徑

N ocardia rubra為諾卡氏菌屬 (N ocardiofor m actinom ycetes)的紅色諾卡氏菌,其細(xì)胞壁 (N-CWS)由諾卡氏菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘肽等組成[1]。Azuma等于 1976和 1978年相繼報(bào)道了 N ocardia rubra細(xì)胞壁骨架 (N-CWS)注射給藥的抗癌免疫佐劑活性[2,3]。研究表明,N-CWS適用于各種腫瘤引起的胸腹水的控制,肺癌、晚期胃癌和食道癌等的輔助治療[4],但臨床上注射給藥可能出現(xiàn)局部皮膚紅腫結(jié)節(jié),潰瘍,部分患者有發(fā)熱反應(yīng)等副作用[5],影響患者的繼續(xù)治療。本研究對(duì)小鼠灌胃給藥 NCWS,考察其體內(nèi)細(xì)胞毒作用和對(duì)小鼠的毒性、免疫活性及對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑瘤效應(yīng)等生物活性,并初步探討其作用機(jī)理,旨在為其尋找最佳的給藥途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與主要試劑

N-CWS(本所提供),ConA (SIG MA),MTT (SIG MA),DMSO為 AR,RPM I1640(G IBCO),中性紅(上海試劑三廠)。

1.1.2 動(dòng)物

ICR小白鼠(購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,雌雄各半,體重 18 g～22 g)。

1.1.3 瘤株

肉瘤 S180及艾氏腹水瘤 EAC(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物所,福建醫(yī)科所傳代保種)。

1.1.4 儀器

雙目顯微鏡 (OLY MPUS),XDS-1倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠),酶標(biāo)儀 (日本 B ID-RAD 550), CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó) Cole Parmer)。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗(yàn)

采用最大給藥量法,20只小鼠,雌雄各半,體重18～22 g,給予N-CWS 30 mg/mL,每只小鼠灌胃 0. 80 mL,連續(xù) 14天觀察小鼠出現(xiàn)的反應(yīng)。

1.2.2 對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑瘤試驗(yàn)

抽取生長(zhǎng) 7d的 S180小鼠腹水調(diào)整成 5×106細(xì)胞/mL的懸液,小鼠右腋皮下接種 0.2 mL/只,接種次日開(kāi)始給藥。給藥方法:試驗(yàn)組按不同劑量 (NCWS 200、400、800 mg/kg)每日定時(shí)灌胃給藥 0.5 mL/只,連續(xù) 15 d。對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。停藥次日解剖,取瘤稱重,計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3 體內(nèi)細(xì)胞毒試驗(yàn)—W inn Test

小鼠灌胃給藥方法同 1.2.2。停藥次日處死小白鼠,無(wú)菌采取腹腔液,離心洗滌,鏡檢計(jì)數(shù),活性在95%以上,調(diào)整巨噬細(xì)胞的濃度為 5×107/mL。將 5 ×107/mL MΦ懸液與艾氏腹水瘤 (EAC)細(xì)胞懸液(1×108細(xì)胞/mL)等量混合,取 0.2 mL接種至小鼠右腋皮下,第 14 d解剖,稱瘤重。

1.2.4 免疫器官影響試驗(yàn)

小鼠灌胃給藥方法同 1.2.2,停藥次日眼眶采血,行外周白細(xì)胞計(jì)數(shù),處死小白鼠,分別取出胸腺、脾臟并稱重。

1.2.5 巨噬細(xì)胞(Macrophage,MΦ)功能影響試驗(yàn)

小鼠灌胃給藥和制備 MΦ懸液方法分別同1.2.2和 1.2.3,調(diào)節(jié)懸液的MΦ濃度為 2×106/ mL。于 96孔培養(yǎng)板中每孔加 100μL,置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h,棄上清液,洗滌,加入一定量的0.075%中性紅溶液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 h。取出培養(yǎng)板,棄中性紅,清洗,加入細(xì)胞裂解液150μL。靜置過(guò)夜,測(cè)定 570 nm的吸光值 A570,A值表示巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱。

1.2.6 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響試驗(yàn)

無(wú)菌取脾制單個(gè)細(xì)胞懸液,離心收集細(xì)胞,Tris-NH4Cl緩沖液溶解紅細(xì)胞后離心洗滌,將細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)液。取一定濃度的懸液接種于 96孔板中(100μL/孔),同時(shí)加入一定量的N-CWS,設(shè)立 3復(fù)孔,另設(shè)培養(yǎng)液空白對(duì)照孔,細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)照孔及Con A陽(yáng)性對(duì)照孔,總量為 200μL/孔。于 5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 72 h。每孔加入 15 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,加入 100μL DMSO,測(cè)定波長(zhǎng)為 570 nm處的吸光度 A570,計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增強(qiáng)率。

2 結(jié)果

2.1 N-CWS的毒性

N-CWS樣品以最大給藥量給藥,未見(jiàn)小鼠有任何異常,繼續(xù)觀察 14 d,小鼠未見(jiàn)任何毒性反應(yīng),結(jié)果表明口服N-CWSLD50>1.2 g/kg,提示N-CWS口服給藥毒性低。

2.2 N-CWS的抑瘤作用

接種 S180次日開(kāi)始連續(xù)灌胃給藥 15 d進(jìn)行治療試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表 1。與對(duì)照組比較,治療給藥低劑量、中劑量和高劑量組對(duì)小鼠 S180的抑瘤率分別為63.33%、71.11%、64.88%,表明 N-CWS口服給藥對(duì) S180腹水型轉(zhuǎn)實(shí)體瘤具有顯著的治療作用。

表 1 N-CWS對(duì)小鼠 S180的抑瘤作用Table 1 Effects of N-CWS on suppression of tumor growth of S180in mice

2.3 N-CWS的細(xì)胞毒作用

考察試驗(yàn)組和對(duì)照組 (巨噬細(xì)胞∶瘤細(xì)胞效靶比 =1∶2)的體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的功能,結(jié)果見(jiàn)表2,與對(duì)照組比較,試驗(yàn)低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤重均明顯低于對(duì)照組,表明N-CWS口服給藥具有提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。說(shuō)明 N-CWS活化的巨噬細(xì)胞明顯增強(qiáng)抗瘤活性,提示其抗腫瘤過(guò)程中的非特異性免疫促進(jìn)作用。

表 2 N-CWS對(duì)巨噬細(xì)胞抑瘤活性的影響Table 2 Inhibitory effects of N-CWS on the growth of EAC in vivo

2.4 N-CWS對(duì)免疫器官的影響

通過(guò)灌胃給藥N-CWS免疫小鼠,采血,白細(xì)胞計(jì)數(shù),并取出胸腺脾臟稱重,結(jié)果見(jiàn)表 3。與對(duì)照組比較,低劑量組顯著提高白細(xì)胞數(shù)量 (P<0.05),中劑量組顯著提高白細(xì)胞數(shù)量和小鼠胸腺明顯增重(P<0.05),高劑量組顯著提高白細(xì)胞數(shù)量和小鼠胸腺脾臟均明顯增重 (P<0.05),表明適當(dāng)劑量的N-CWS明顯增加胸腺脾臟重量和提升白細(xì)胞數(shù)量。提示N-CWS對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)具有明顯的刺激作用。

表3 N-CWS對(duì)小鼠免疫器官的影響Table 3 Effects ofN-CWS on immune organs ofmice

2.5 N-CWS對(duì)MΦ吞噬功能的影響

N-CWS連續(xù)定時(shí)灌胃給藥 15 d,停藥次日測(cè)定小鼠的MΦ吞噬中性紅的作用,結(jié)果見(jiàn)表 4。與對(duì)照組比較,N-CWS低、中劑量組均具有明顯地提高小鼠MΦ吞噬中性紅的作用 (P<0.05),而高劑量組非常顯著地提高小鼠MΦ吞噬中性紅的作用 (P <0.01),說(shuō)明N-CWS在一定劑量下具有明顯的激活小鼠腹腔MΦ和機(jī)體應(yīng)激能力,其激活小鼠腹腔MΦ和機(jī)體應(yīng)激能力及提高機(jī)體免疫功能與劑量呈正相關(guān)。說(shuō)明N-CWS口服給藥具有提高小鼠MΦ的吞噬活性的功能。

表 4 N-CWS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的影響Table 4 Effects ofN-CWS on murine peritonealMΦphagocytic neutral red

2.6 N-CWS對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

無(wú)菌制備濃度為 1×107/mL小鼠脾 T淋巴細(xì)胞懸液,于 96孔板中每孔加入 100μL懸液,同時(shí)加一定量的N-CWS,于 5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),采用MTT法測(cè)定波長(zhǎng)為 570 nm處的吸光度,結(jié)果N-CWS組與Con A陽(yáng)性對(duì)照組均明顯提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)能力,見(jiàn)表 5。說(shuō)明N-CWS具有促進(jìn) T淋巴細(xì)胞增殖的作用。

表 5 N-CWS對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響(n=5)Table 5 Effects ofN-CWS on lymphocyte transformation(n=5)

3 討論

本課題組前期工作表明,注射給藥N-CWS不但在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投以谂R床觀察中都顯示出增加宿主抗癌免疫功能而達(dá)到延長(zhǎng)宿主生存期的作用。研究亦顯示,具有抗腫瘤作用的N-CWS其機(jī)制與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)嘗試灌胃給藥,結(jié)果證實(shí)N-CWS具有明顯抑制 S180腹水型轉(zhuǎn)實(shí)體瘤的作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以此給藥方式N-CWS不僅對(duì)小鼠非特異性免疫功能有增強(qiáng)作用,而且對(duì)特異性免疫功能也有明顯的促進(jìn)作用。低劑量N-CWS即已顯示明顯的MΦ激活效果,在MΦ吞噬活性增強(qiáng)的同時(shí)促進(jìn)胸腺和脾臟器官的增長(zhǎng)、白細(xì)胞數(shù)量顯著的提升,且提高 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,促進(jìn) T淋巴細(xì)胞的生成,提示在適當(dāng)?shù)膭┝肯翹-CWS具有刺激 T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的作用。體內(nèi)W inn中和試驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)N-CWS口服給藥激活的小鼠腹腔MΦ對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)明顯增強(qiáng),提示增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能是其抗腫瘤的重要機(jī)理。有關(guān)口服N-CWS促進(jìn)白細(xì)胞介素-2和腫瘤細(xì)胞壞死因子-α生成等研究工作我們也將后續(xù)展開(kāi),為進(jìn)一步闡明N-CWS提高機(jī)體免疫抗腫瘤的作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)NCWS口服給藥的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 Zhang ZL(張祝蘭),Lin S(林善),TangWL(唐文力),et al.Studies on the physico-chemical properties,composition and content determination ofNocardia rubracell wall skeleton.Chin J Antibiotics(中國(guó)抗生素雜志),2002,27:532-534.

2 Azuma I,Taniyama T,YamawakiM,et al.Adjuvant and antitum or activities ofNocardia rubracellwall skeletons.Gann, 1976,67:733-736.

3 Azuma I,YamawakiM,Yasumoto K,et al.Antitumor activity ofNocardia rubracell wall skeleton preparation in transplantable tumors in syngeneic mice and patients with malignant pleurisy.Cancer Imm unol Imm unother,1978,4:95-100.

4 Ye BP(葉波平),Wang Y(王穎),Jin GQ(金國(guó)虔),et al. A new way ofNocardia rubracellwall skeleton(N-CWS)in treating liver disease(紅色奴卡氏放線菌細(xì)胞壁骨架用于治療肝臟疾病的新用途).CN100341574C,2007-10-10.

5 Li H(李惠).Observation and nursing of N-CWS in treating malignant hydrothorax.Practical J Cardiac Cerebral Pneum al and VascularD isease(實(shí)用心腦肺血管病雜志),2003,11: 308-309.

6 Lin YX(林躍鑫),Sheng Y(盛盈),Lu ZX(路歧詳),et al. Inhibitory Effect ofNocardia rubracell wall skeleton(NCWS)on mice bearing lewis lung carcinoma.J Fujian Normal Univ(福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)),2003,19(3):67-69

Effect ofNocardia rubraCellWall Skeleton(N-CW S)on Transplanted Tumor and Immunological Function in M ice Given Through Oral Adm in istration

ZHANG Zhu-lan＊,TANGWen-li,YANG Huang-jian,WANG Juan,HONG Jin-ji
Fujian Institute of M icrobiology,Fuzhou 350007,China

Itwas studied the effect ofNocardia rubracellwall skeleton(N-CWS)on transplanted tumor and immunological function in mice given in oral administration.Transplanted tumormodel of sarcoma 180 in mice was used to evaluate the antitumor effect ofN-CWS.Meanwhile the immune organ weights,the phagocytosis of peritonealmacrophage and the lymphocyte transfor mation were determined in nor malmice.After oral administration ofN-CWS 200,400,800 mg/kg to mice,the inhibition rates on sarcoma 180 were 63.33%,71.11%,64.88%.The medial lethal dose(LD50)of N-CWS wasmore than 1.2 g/kg.Comparedwith control group,the spleen and thymusweights in nor malmicewere increased obviously(P<0.05),the lymphocyte transfor mation and the phagocytosisofperitonealmacrophage from micewere also increased(P<0.05).In conclusion,N-CWS could be given via oral administration.It has the antineoplastic effect,partially,by enhancing immunological function.

N-CWS;antitumor;immunological function;drug administration route

1001-6880(2010)02-0228-04

2009-03-19 接受日期:2009-05-18

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007J0248)

＊通訊作者 Tel:86-591-83470740;E-mail:jessylan9963@sina.com

R392;Q58

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