解美娜,李鋒杰

濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心,山東 261053

無花果枝提取物體外誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的研究

解美娜＊,李鋒杰

濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心,山東 261053

為探討新鮮無花果枝提取物(FBE)對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株BGC-823增殖和凋亡的影響,用不同濃度 FBE處理胃癌BGC-823細(xì)胞,采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,細(xì)胞活力測定 (MTT法)及免疫組織化學(xué)法檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)情況來評價 FBE對BGC-823細(xì)胞體外增殖的影響,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶技術(shù)(Annexin V/PI法)檢測 FBE誘導(dǎo) BGC-823細(xì)胞體外凋亡的情況。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)中高劑量 (>0.5 mg/mL)組處理 4 h細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡,24 h檢測到中高劑量 (>0.5 mg/mL)組細(xì)胞增殖活力和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)顯著降低(P<0.05),流式細(xì)胞儀檢測到 FBE處理 4 h所有劑量組細(xì)胞平均凋亡率 (9.76%,10.87%, 14.29%,49.67%,71.37%)均高于對照組 (6.1%)(P<0.05或 P<0.01),以上作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性。以上結(jié)果說明無花果枝提取物能夠通過誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡從而抑制其體外的生長與增殖。

無花果枝提取物;胃癌細(xì)胞;增殖;凋亡

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年升高[1],嚴(yán)重危害人類的健康和生活質(zhì)量?；熓俏赴┑闹饕委熓侄沃?但是目前常用方案的化療效果并不太理想,因此尋找有效的治療胃癌或延長胃癌患者生存期的傳統(tǒng)中藥成為臨床治療所必需。無花果系?？茻o花果屬植物 (Ficus caricaI),其果實含有多種人體所需的維生素、氨基酸、酶類以及微量元素,可以藥食兩用[2]。近年來的研究表明,無花果具有抗疲勞、抗衰老[3]、抗病毒[4,5]、抗肺癌[6]等作用,對胃潰瘍也有顯著療效[6]。目前大部分研究集中在對無花果果實和葉的研究[3,6,8],還未見對無花果枝抗癌方面的研究,本實驗以人胃癌細(xì)胞株 SGC-823為靶細(xì)胞,探討無花果枝提取物(FBE)對腫瘤細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株 BGC-823購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑

培養(yǎng)液 RPM I-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自 Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(lán)購自 SIG MA公司;Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;PCNA一抗及免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中杉公司;無花果枝五月初采自煙臺。

1.1.3 主要儀器

FACS Calibur流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為熱電公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)為LEI CA公司產(chǎn)品;全波長酶標(biāo)儀為基因公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 無花果枝提取物制備

無花果枝 60 g,切碎,加入蒸餾水 300 mL,煮 40 min,將水溶液離心 4000 r/min×10 min,取上清,用冷凍干燥機(jī)凍干成粉末狀,-20℃保存,用前用 RPM I-1640培養(yǎng)液稀釋,離心 8000 r/min×10 min,兩次,取上清,0.22μm濾膜過濾,備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存細(xì)胞復(fù)蘇后,加入適量 RPM I-1640培養(yǎng)液(含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)接種于培養(yǎng)瓶或 96孔培養(yǎng)板中。放培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng),每隔 2～3 d傳代 1次。選對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗,細(xì)胞濃度為 2×105個/mL。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度 FBE(0、0.025、0.25、0.5、1.0、2.5 mg/mL),每種劑量設(shè)四個重復(fù)。觀察細(xì)胞生長增殖狀況及形態(tài)變化,并拍照。

1.2.3 細(xì)胞增殖活力檢測(MTT法)

FBE處理 24 h后,加入MTT(0.25 mg/mL)后放入 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸除培養(yǎng)液,每孔加入 100μL DMSO溶解紫色顆粒,然后用酶標(biāo)儀測 570 nm下的吸光度 (OD)值,實驗重復(fù)三次。

1.2.4 PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)

培養(yǎng) 24 h的細(xì)胞用 PBS洗 15 min(5 min×3),用冷甲醇/丙酮固定液(3:1)固定 20 min,晾干。3%H2O2孵育 10 min滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水沖洗, PBS浸泡 10 min。滴加山羊血清封閉液,室溫 20 min,甩去多余液體,不洗。滴加小鼠抗 PCNA抗體, 4℃過夜,PBS(pH 7.2～7.6)洗 2 min×3。滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG,37℃孵育 20 min,PBS洗 2 min×3。滴加試劑 SABC,37℃孵育 20 min,PBS洗5 min×4。DAB顯色。

1.2.5 Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡

不同濃度 FBE作用 4 h后收獲細(xì)胞移入試管, PBS洗滌 1次,400μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。取200μL細(xì)胞懸液加入AnnexinV 5μL,PI10μL避光20 min,加入 200μL Binding Buffer上流式細(xì)胞儀檢測。用 Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù),用ModFit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用 SAS(6.12版本)軟件中 GLM過程進(jìn)行方差分析及Duncan’s進(jìn)行多重比較,檢驗誤差為5%和1%水平。

2 結(jié)果

2.1 FBE對BGC-823細(xì)胞形態(tài)的影響

FBE處理組(>0.5 mg/mL)胃癌細(xì)胞生長受到抑制,并出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,倒置顯微鏡下正常組細(xì)胞多呈多角形貼壁生長,而加入 FBE處理 4 h,細(xì)胞即出現(xiàn)胞漿空泡化,核固縮 (圖 1),24 h后細(xì)胞變圓,脫壁,低劑量組未見明顯改變。

圖 1 不同濃度 FBE處理4 h后BGC-823細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphology changes of BGC-823 cells after treatment by different concentration of FBE for 4 h

2.2 FBE對BGC-823細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 FBE抑制BGC-823細(xì)胞增殖活力

FBE對人胃癌細(xì)胞增殖有抑制作用,并呈劑量效應(yīng)關(guān)系,當(dāng)濃度高于 0.5 mg/mL時,具有顯著抑制作用(P<0.05)(圖 2)。

圖2 不同濃度 FBE處理BGC-823細(xì)胞24 h細(xì)胞增殖活力與 0 mg/mL組比較的變化Fig.2 Proliferating activity changes ofBGC-823 cells after treatment by different concentration of FBE for 24 h contrastwith 0 mg/mL group

2.2.2 FBE對 PCNA表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,處理組細(xì)胞 (0.5, 1.0,2.5 mg/mL劑量組)比對照組陽性細(xì)胞減少,其陽性率 (分別為 85.2% ±0.76%,80.1% ±1. 56%,72.4%±1.5%)比對照組陽性率 (95.3% ± 2.3%)顯著降低 (P<0.05)。

2.3 FBE誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞早晚期凋亡的變化

在凋亡的早期階段,胞漿膜磷脂的不對稱性喪失,導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸 (PS)從細(xì)胞膜內(nèi)層暴露于外層,從而可被 PS特異的Annexin V探針?biāo)鶚?biāo)記。流式 Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)圖上 (圖 3)可見,早期凋亡細(xì)胞位于右下象限(FITC+,PI-),晚期凋亡細(xì)胞位于右上象限 (FITC+,PI+),左下象限為活細(xì)胞 (FITC-,PI-),左上象限為壞死細(xì)胞(FITC-,PI+)。不同濃度的 FBE在 4 h即可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,隨著劑量增加早期凋亡細(xì)胞不斷增加,并逐漸向晚期凋亡過渡,不同劑量 (0、0.025、0.25、0.5、1.0、2.5 mg/mL)平均凋亡率分別為 6.1%,9.76%,10.87%,14.29%,49.67%, 71.37%。不同濃度無花果枝提取物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與對照組相比差異均有顯著性意義 (P<0.05,P <0.01)(圖 4)。

3 討論

圖 3 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度 FBE處理 4 h BGC-823細(xì)胞的凋亡情況Fig.3 Apoptosis ofBGC-823 cells detected by FCM after trea tment by different concentration of FBE for 4 h

近年我國各類癌癥發(fā)病率日益上升,迫切需要研發(fā)出既能抑制癌細(xì)胞增殖甚至凋亡而又對人體危害較少的藥物,因此開發(fā)天然抗癌藥物成為研究熱點。由于無花果含有多種不同生物活性的化學(xué)成分,近年來對無花果的研究日益增多,但多集中在對其果實、果漿、根和葉的研究上,其葉的提取物具有抗新城疫病毒、單純皰疹病毒和抑菌活性[7,8],其果實提取物和果漿能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞的凋亡[9,10]。但是目前對無花果枝的研究還很少,由于枝比果實和葉的存活時間長,突破了對季節(jié)的依賴性且更容易大量獲取,因此具有重要的研究價值。本實驗采用冷凍干燥機(jī)凍干成粉末冷凍保存,可盡可能減少保存對其效果的影響并保證劑量的準(zhǔn)確性。

圖 4 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度 FBE處理 4 h BGC-823細(xì)胞的早晚期平均凋亡率Fig.4 Early and late apoptosis of BGC-823 cells detected by FCM after treatment by different concentration of FBE for 4 h

本實驗通過觀察 FBE對胃癌細(xì)胞株 BGC-823體外生長、增殖、凋亡的影響,通過檢測細(xì)胞增殖活力,免疫組織化學(xué)法檢測 PCNA的表達(dá)量變化以及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,探討了 FBE對胃癌細(xì)胞株BGC-823的生長抑制及凋亡作用。雖然低濃度劑量組在形態(tài)上和細(xì)胞活力檢測的結(jié)果中作用不是很明顯,但是流式的檢測結(jié)果表明,當(dāng)濃度低至0.025 mg/mL時,無花果枝提取物作用 4 h對BGC-823細(xì)胞仍具有誘導(dǎo)凋亡的作用。可能是因為此時細(xì)胞處于早期凋亡階段,在形態(tài)方面和酶代謝方面改變不是很明顯,這也證實應(yīng)用流式細(xì)胞儀的檢測早期凋亡比形態(tài)學(xué)和酶學(xué)更加靈敏。同時藥物劑量的降低也避免了對培養(yǎng)體系滲透壓、PH值等其它因素的改變,更加有力證實了無花果的真實效果。

本實驗結(jié)果表明,FBE對胃癌細(xì)胞株 BGC-823體外增殖具有明顯抑制作用,可能是通過誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。在凋亡早期細(xì)胞膜完整而磷脂酰絲氨酸(PS)膜外翻現(xiàn)象,而到晚期細(xì)胞膜完整性被破壞,凋亡細(xì)胞裂解成凋亡小體,通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可以來達(dá)到治療腫瘤的目的。因此有關(guān)無花果枝水提取物抑制胃癌細(xì)胞生長增殖以及誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的基礎(chǔ)研究,對于臨床應(yīng)用的指導(dǎo)意義十分重要,還有待進(jìn)一步研究。

1 Sun XD(孫秀娣),Mu R(牧人),Zhou YS(周有尚),et al. Analysis ofmortality rate of stomach cancer and its trend in twenty years in China.Chin J Oncol(中華腫瘤雜志), 2004,16:4-9.

2 Mao XW,Chen YD,YangL,et al.Studyonmain composition extraction separation of Fig and application.J Chem Indus Forest Prod,1998,6:22-25.

3 Vinson JA,Zubik L,Bose P,et al.Dried fruits:excellent in vitro andin vivoantioxidants.J Am Coll Nutr,2005,24:44-50.

4 Wang GT(王桂亭),Wang H(王皞),Song YY(宋艷艷), et al.Anti-NDV Effect of extract fromFicus caricaleave. Chin J Zoonoses(中國人獸共患病雜志),2005,21:710-712.

5 Su GF(宿廣峰),Li YL(李淵玲).Anti-HSV activity of ethanolic and aqueou extract fromFicus caricaleave.Shandong J TCM(山東中醫(yī)雜志),2006,12:842-844.

6 Liu J(劉軍),Zhang BJ(張百江).Proliferation inhibition and apoptosis induction of Fig extract on human lung cancer cells.Chin J Cancer Prev Treat(中國腫瘤防治雜志), 2008,15:665-667.

7 Rao ChV,Ver ma AR,VijayakumarM,et al.Gastroprotective effect of standardized extract ofFicus glom eratafruit on experimental gastric ulcers in rats.J Ethnophar m acol,2008, 115:323-326.

8 Zhao AY(趙愛云),Wu SY(吳神怡),Du GC(杜桂彩). Experiment study of antibacterial constituents ofFicus carica leaves.J Q ingdao Univ(青島大學(xué)學(xué)報),2005,18(3):37-40.

9 Wang J(王靜),Wang XJ(王修杰),Lin P(林蘋),et al. Proliferation inhibition and apoptosis induction of fig fruit latex on human cancer cells.Nat Prod ResDev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2006,18:760-764.

10 Rubnov S,Kashman Y,Rabinowitz R,et al.Suppressors of cancer cell proliferation from Fig(Ficus carica)resin:isolation and structure elucidation.Nat Prod,2001,64:993-996.

Apoptosis of Human Gastric Cancer L ine BGC-823 Induced by Fig Branch Extract

XIEMei-na＊,L I Feng-jie
M edicine Experiment Center,W eifang M edical University,Shandong 261053,China

To illustrate the growth inhibition and apoptosis in human gastric cancer BGC-823 cells treated with Fig Branch extract(FBE),morphologic changes of gastric cellswere observed under an inversion microscope,colony formation inhibition and immunohistochemical staining detecting the expression of PCNA were used to reveal the effectof FBE on proliferation ofBGC-823 cells,and flow cytometrywas used to determine the apoptosisof cells byAnnexinV/PIassay after treated with various concentration of FBE in vitro.Morphologic alterations of cells were observed after treated with middle dose and high dose(>0.5 mg/mL)of FBE for four hours.Cellproliferation was inhibited and the expression of PCNA in the cellswere decreased bymiddle dose and high dose(>0.5 mg/mL)of FBE(P<0.05).Flow cytometry analysis revealed significantly greater increase in apoptosis cells(9.76%,10.87%,14.29%,49.67%,71.37%)contrastwith control group(6.1%)after treatment with all doses of FBE for four hours(P<0.05 orP<0.01).Fig branch extractmay inhibit the growth and proliferation of human gastric cancerBGC-823 cells through inducing cell apoptosis.

fig branch extract;gastric cancer cell;proliferation;apoptosis

1001-6880(2010)02-0219-04

2009-03-31 接受日期:2009-07-20

濰坊醫(yī)學(xué)院青年教師啟動基金(KQ07004)

＊通訊作者 Tel:86-536-8462462;E-mail:xiemeina@wfmc.edu.cn

Q946.91;R285

A