趙 萱，蔡啟舟，何 劍，顧雪楠，鄭玉峰

(1. 華中科技大學 材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室，武漢 430074；2. 北京大學 工學院, 北京 100871)

La對純鈦微弧氧化膜層的組織結(jié)構(gòu)及細胞相容性的影響

趙 萱1，蔡啟舟1，何 劍1，顧雪楠2，鄭玉峰2

(1. 華中科技大學 材料成形與模具技術(shù)國家重點實驗室，武漢 430074；2. 北京大學 工學院, 北京 100871)

在乙酸鈣?磷酸二氫鈣電解液中添加硝酸鑭，對純鈦進行微弧氧化處理，利用XRD、SEM和EDX分別研究了 La元素對膜層形貌、成分、物相的影響及作用機制，并利用細胞接種方法研究膜層的生物活性。結(jié)果表明：電解液中添加 La降低膜層厚度，增加膜層孔洞尺寸，抑制銳鈦礦向金紅石型轉(zhuǎn)變，并在微弧氧化過程中具有促進羥基磷灰石HA形成的能力。煅燒處理使膜層中的非晶HA晶化，形成片狀和鱗狀的HA晶體；膜層經(jīng)煅燒后形成的HA/TiO2復合膜具有良好的細胞相容性。

La; 純鈦；微弧氧化；羥基磷灰石; 細胞相容

羥基磷灰石(Hydroxyapatite，簡稱HA，化學式為Ca10(PO4)6(OH)2)是一種生物陶瓷，與人體硬組織成分的晶體結(jié)構(gòu)相同，且具有良好的生物相容性[1]。但從生物力學的角度看，HA屬于脆性材料，難以單獨作為硬骨替代材料。而以不銹鋼等為代表的醫(yī)用金屬材料具有良好的機械性能，但金屬材料的生物相容性差，在人體環(huán)境中會向肌體釋放有害的金屬離子，植入時間久會產(chǎn)生腐蝕等一系列問題。結(jié)合以上兩種材料各自在硬骨替代品上的優(yōu)劣，現(xiàn)在研究人員大多采用在HA涂層/金屬優(yōu)化的思路進行硬骨替代品的研究[2]。

鈦及鈦合金的密度與人骨密度接近，相對其他金屬材料具有較好的生物相容性、力學性能和耐腐蝕性，并且對大多數(shù)消毒方式都能適應，是一種理想的醫(yī)用材料。近年來，關于如何在鈦及鈦合金基體上制備HA的報道有很多。目前，主要的方法有等離子噴涂[3]、溶膠凝膠[4]、電化學沉積[5]、微弧氧化[6]等。其中微弧氧化方法(Micro-arc oxidation，簡稱MAO)是一種在金屬表面原位生長陶瓷層的表面處理工藝[6]，可以通過調(diào)節(jié)電解液成分控制Ca和P元素的比例，相比其他工藝具有獨特的優(yōu)勢，如工作溫度低、工藝過程簡單、可處理復雜形狀的金屬表面等。目前，要制得HA大都要在微弧氧化后進行堿熱處理和模擬體液浸泡的后續(xù)處理[7]，但模擬體液浸泡往往要一到兩周的時間，明顯不利于實際應用，因此如何縮短獲得高結(jié)晶度 HA的工藝流程應該是一個值得探索的方向。以往對于HA粉末的研究結(jié)果表明，鑭摻雜具有抑制牙齒脫礦的作用，且對成骨細胞無毒性反應[8?9]，適量攝入有利于提高機體的免疫力，同時，它也是有效的抑癌物質(zhì)[10]。黃勇等[11]報道在乙酸鈣、β-甘油磷酸鈣與硝酸鑭電解液中，采用微弧氧化方法在純鈦表面制得了含有HA的涂層。而La在其他電解液體系中對微弧氧化膜形成的影響鮮見報道，且 La元素對膜層生長、組成及結(jié)構(gòu)的影響也有待深入分析。

為此，本文作者在乙酸鈣?磷酸二氫鈣的電解液體系中添加硝酸鑭，利用微弧氧化法在純鈦表面制備HA/TiO2膜層，分析膜層的結(jié)構(gòu)與組成及其細胞相容性，并探討La促進HA形成的作用機理。

1 實驗

1.1 實驗材料

將尺寸為30 mm×20 mm×1 mm的純鈦片依次經(jīng)600#、1200#、2000#水砂紙打磨后，用丙酮和去離子水清洗，吹干后用于微弧氧化處理。按照表1所列組分配制電解液。

1.2 實驗裝置及參數(shù)

采用 μArc-II型雙極性脈沖微弧氧化裝置對純鈦試樣進行處理(MAO裝置圖見圖1)，試驗電源為雙向脈沖方波，正壓設為300 V，負壓為30 V，占空比和頻率分別恒定在0.2和600 Hz，處理時間為15 min，溶液溫度控制在25～40 ℃。經(jīng)A組電解液處理得到的試樣組標記為MAO-A，經(jīng)B組處理得到的試樣組標記為MAO-B。

表1 微弧氧化電解液成分Table 1 Chemical compositions of micro-arc oxidation electrolyte

圖1 MAO裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of MAO system: 1—Pulse power source; 2—Electrolysis bath; 3—Electrolyte; 4—Cooling pool; 5—Magnetic rotator; 6—Magnetic stirring apparatus; 7—Stainless steel; 8—Pure titanium sample; 9—Supporting table

1.3 樣品的性能及表征

采用荷蘭帕納科公司生產(chǎn)的X′Pert PRO型X射線衍射儀(Cu靶，Kα射線，40 kV，40 mA，衍射角2θ為 20°～80°)分析膜層的相組成，利用 Scherrer公式D=kλ/(βcosθ)求得晶粒大小。式中，k為常數(shù)，0.89；λ為X射線波長，λ=0.154 06 nm；θ為布拉格衍射角；β是半峰高處的寬度。用荷蘭FEI公司生產(chǎn)的Quanta 200環(huán)境掃描(ESEM)觀察膜層表面形貌及截面形貌，對膜層進行預噴碳處理，并利用ESEM附帶的EDAX分析膜層組成中的元素。

1.4 樣品的生物相容性

將制備好的微弧氧化試樣，經(jīng)丙酮、乙醇、去離子水超聲各10 min，然后紫外消毒2 h，放置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，將L-929小鼠成纖維細胞以100 000/mL的密度接種到樣品表面。在CO2體積分數(shù)為 5%、飽和濕度（相對濕度）為100%、37 ℃環(huán)境下分別培養(yǎng)1、3、5 d后終止培養(yǎng)，取出樣后PBS沖洗3遍，依次用2.5%的戊二醛固定 2 h，乙醇梯度脫水，真空干燥，噴金后在掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜層的形貌分析

經(jīng)微弧氧化后A組與B組的表面及截面形貌如圖2所示。從圖 2(a1)和(b1)易知，經(jīng)過微弧氧化后，兩組純鈦表面均呈粗糙多孔狀， MAO-B較之 MAO-A的孔洞更加均勻、圓整，孔徑更小(1～3 μm)。同時，對比圖 2(a2)和(b2)，MAO-B表面出現(xiàn)的微裂紋比MAO-A多。

圖2 由A、B兩組電解液制得的MAO膜表面及截面形貌Fig.2 Surface morphologies ((a1), (a2), (b1), (b2)) and cross sectional morphologies ((c1), (c2)) of MAO coatings gained from electrolytes A and B: (a1), (a2), (c1) MAO-A; (b1), (b2), (c2) MAO-B

對比圖2(c1)與(c2)可以看出， 兩種膜層均與基體純鈦發(fā)生嚙齒狀冶金結(jié)合，膜層均由致密層和疏松層組成。MAO-B的致密層與疏松層之間的孔隙較MAO-A膜層的更為細小，即結(jié)合得更加緊密。同時，MAO-B膜層外表面比 MAO-A膜層外表面更為更粗糙。文獻[12]表明，細胞生長具有親粗糙性。純鈦表面經(jīng)過微弧氧化后所出現(xiàn)的這種粗糙的火山狀多孔結(jié)構(gòu)以及凹凸不平的表面有利于細胞的粘附生長。MAO-B膜層比MAO-A膜層薄，這與文獻[11]報道的膜厚隨電解液中La含量增加而減小的結(jié)果一致。

2.2 膜層表面的元素組成

圖3所示為采用電解液A、B制得微弧氧化膜層的能譜結(jié)果。表2所列為MAO-A和MAO-B兩種膜層中的元素組成及其含量。MAO-A的 n(Ca)/n(P)為1.95，而MAO-B的n(Ca)/n(P)為2.32，二者均大于純HA的n(Ca)/n(P)。在MAO-B表面未檢測到La元素的存在，這可能是膜層中 La元素含量過低造成的。對比兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，La元素在一定程度上抑制了 Ca和P進入膜層，且對P元素的阻礙作用更大。

表2 MAO-A和MAO-B表面成分及其含量Table 2 Chemical composition and contents of MAO-A and MAO-B surfaces

2.3 膜層表面的物相組成

MAO-A和MAO-B的X射線衍射分析(XRD)分別如圖4和5所示。由圖4可以看出，MAO-A膜層主要由 Ti以及銳鈦礦(Anatase)和金紅石(Rutile)型 TiO2組成，沒有Ca和P元素組成的物相，其中的Ti的衍射峰為純鈦基體的衍射峰。與之相對的圖 5顯示MAO-B膜層中主要的銳鈦礦和金紅石組成，未檢測到Ti的基體峰， 這是由于MAO-A形成較多的通孔，X射線可以探到基體，而MAO-B中形成的孔洞中的通孔很少，只有少量X射線能探到基體造成的。

2.4 膜層MAO-B煅燒后的物相及形貌

圖5中2θ處于25°～35°出現(xiàn)了一個非晶包，為驗證非晶組成，對MAO-B在800 ℃進行2 h的煅燒處理[13]，將所得試樣組標記為 MAO-B-H，其 XRD和SEM結(jié)果分別如圖6和7所示。

圖3 由A、B兩組電解液制得的MAO膜表面形貌及相應的EDX譜Fig.3 Morphologies and corresponding EDX spectra of MAO coatings gained from electrolytes A and B: (a), (b) MAO-A; (c), (d)MAO-B

從圖6可看出，MAO-B-H膜層中出現(xiàn)了結(jié)晶度完好的HA和磷酸鈣，從而證實MAO-B中含有非晶態(tài)的HA和磷酸鈣。根據(jù)Scherrer公式計算，MAO-B-H膜層中HA的平均粒晶尺寸為48.8 nm。

圖4 MAO-A的XRD譜Fig.4 XRD pattern of MAO-A

圖5 MAO-B的XRD譜Fig.5 XRD pattern of MAO-B

圖6 MAO-B-H的XRD譜Fig.6 XRD pattern of MAO-B-H

圖7 MAO-B-H的表面形貌Fig.7 Surface morphology of MAO-B-H

由圖7可以看出，煅燒后膜層的孔徑變大，大約為2～5 μm，微弧氧化后，原本比較光滑的氧化膜表面生長出棒狀的晶體。這樣，更粗糙的表面形貌更有利于細胞的粘附生長。

對比圖5和6可以清晰地看出，膜層存在銳鈦礦減少、金紅石增多的現(xiàn)象。這是由于本實驗采用的熱處理溫度處于銳鈦礦與金紅石之間的轉(zhuǎn)變溫度區(qū)間(400～1 200 ℃)[14]，因而發(fā)生銳鈦礦向金紅石的轉(zhuǎn)變。熱處理之后，在膜層表面檢測到了新的相——磷酸鈣，表明Ca和P元素經(jīng)過微弧氧化后已進入了膜層， 并以非晶相的形式存在于膜層中。

2.5 體外細胞培養(yǎng)實驗

將成纖維細胞L-929接種于MAO-B-H微弧氧化膜上進行細胞培養(yǎng)試驗。圖8所示為成纖維細胞在薄膜上培養(yǎng)1、3、5 d后的電鏡照片。由圖8可知，在MAO-B-H薄膜上，未見細胞死亡，可見，材料無明顯的細胞毒性。接種1 d后，細胞附壁生長趨勢良好；3 d后，細胞數(shù)明顯增多，部分細胞偽足已經(jīng)伸入到微弧氧化孔洞之中，并沿著孔洞外壁生長，細胞與材料結(jié)合緊密；5 d后，細胞幾乎長滿MAO-B-H表面，且無細胞畸變。對比細胞培養(yǎng)1、3、5 d后的電鏡結(jié)果，可以得出結(jié)論：本研究所制備的含 La羥基磷灰石生物活性圖層的細胞生物相容性良好，有利于促進骨損傷部位的早期愈合。

3 討論

圖8 成骨細胞在MAO-B-H膜層上培養(yǎng)不同時間后的形貌Fig.8 Morphologies of cell culture of osteoblast on MAO-B-H coating after different cell culture times: (a) 1 d; (b)3 d; (c) 5 d

從圖5和6的結(jié)果可知，電解液中的La元素未進入膜層形成物相，但對HA的產(chǎn)生起了很大的作用。一方面，La元素抑制了銳鈦礦向金紅石型的結(jié)構(gòu)相變[15]，而銳鈦礦比金紅石具有更好的誘導磷灰石形成能力[16]。另一方面，La3+能部分替代 Ti4+進入二氧化鈦晶格形成固溶體[17]。過量的La3+不能進入晶格，而是以混合物形式存在于 TiO2中。在鑭?二氧化鈦混合物中，三價的稀土離子可替代部分四價的鈦離子，從而引起電荷的不平衡，為彌補這種電荷的不平衡，TiO2將吸附較多的氫氧根離子，表面氫氧根離子可與光生空穴反應，生成活性羥基。微弧氧化過程中所產(chǎn)生的TiO2受到活性羥基的攻擊而部分溶解發(fā)生以下反應：TiO2+OH?→HTiO3?

同時，電解液中還伴隨著鈦的水合反應產(chǎn)生水合TiO2，水合TiO2進一步受到羥基的攻擊就會在膜層表面生成帶負電的水合離子，其反應如下：

TiO2·H2O+OH?→HTiO3?·H2O

這種帶負電的物質(zhì)與電解液中的堿離子結(jié)合就生成了一層堿性的 TiO2水凝膠層[18]，凝膠狀態(tài)的 TiO2膜具有誘導體液中鈣和磷離子沉積產(chǎn)生磷灰石的能力，表現(xiàn)出一定的生物活性。

TiO2膜層能夠誘導磷灰石產(chǎn)生的原因就是存在高濃度的Ti—OH基團[19]，但由于含La元素的介入，電解液中形核位點附近的活性羥基遠多于非含 La電解液中的，因而，在MAO-B中出現(xiàn)了HA的非晶包，而在MAO-A中卻沒有。

實驗中發(fā)現(xiàn)，La元素的介入使得實驗中電解液B比電解液A的發(fā)熱量多很多，電解液B中發(fā)生了上述反應而產(chǎn)生了TiO2水凝膠層，該凝膠層同時在微弧氧化電解液中誘導Ca和P離子在膜層中的沉積，從而一步形成了非晶態(tài)的 HA。另外，更高的溫度導致在電解液中更高的溶解速度，這可以為 La元素參與反應生成的膜層比沒有La參與的膜層薄提供解釋。

4 結(jié)論

1) 在乙酸鈣?磷酸二氫鈣電解液添加硝酸鑭，對純鈦進行微弧氧化處理使其表面得到多孔結(jié)構(gòu)的膜層。分析膜層發(fā)現(xiàn)，電解液中添加 La降低了膜層的厚度，膜層孔洞尺寸增大。

2) 電解液中的La元素雖未進入膜層中形成新的物相，但 La元素能抑制銳鈦礦向金紅石轉(zhuǎn)變，并在微弧氧化過程中具有促進HA形成的能力。

3) 煅燒處理使膜層中的非晶HA晶化，形成片狀、鱗狀的HA晶體，且膜層表面孔徑增大，且形成新相磷酸鈣。

4) 將成纖維細胞L-929接種于含有HA晶體的生物活性膜層上，1 d后，細胞可附著在材料表面；3 d后，細胞數(shù)變多并形成一定鋪展；5 d后，細胞長滿膜層表面，初步表明細胞相容性較好。

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Effects of La on microstructures and biocompatibility of pure Ti micro-arc oxidation coatings

ZHAO Xuan1, CAI Qi-zhou1, HE Jian1, GU Xue-nan2, ZHENG Yu-feng2
(1. State Key Laboratory of Material Processing and Die and Mould Technology,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China;2. College of Engineering, Peking University, Beijing 100871, China)

Ca(CH3COO)2·H2O-Ca(H2PO4)·H2O electrolyte system with La(NO3)3·6H2O was used to carry out micro-arc oxidation treatment on pure titanium. By means of XRD, SEM and EDX, the effects of La on morphologies, phases and compositions of coatings gained from the electrolyte were investigated. The cell culture method was used to study the cyto-compatibility of the coating. The results show that the coatings formed in electrolyte with La are thinner and have larger pores than those formed in electrolyte without La. Addition of La can inhibit the transition from anatase to rutile and has stronger capability of inducing HA. After being sintered, the amorphous hydroxyapatite (HA) in coatings is crystallized into flake or scaly. The new coatings after being sintered with HA/TiO2are proved to have good biocompatibility.

La; pure titanium; micro-arc oxidation; hydroxyapatite; ayto-compatibility

TB31

A

1004-0609(2010)12-2394-07

2010-01-06；

2010-05-04

蔡啟舟，教授，博士；電話/傳真：027-87543876；E-mail：caiqizhou@mail.hust.edu.cn

(編輯 李艷紅)