溫 悅，孟德勝，畢小婷（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶市 400042）

正交試驗(yàn)優(yōu)選二氫青蒿素脂質(zhì)體的制備工藝

溫 悅＊，孟德勝#，畢小婷（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶市 400042）

目的：優(yōu)選二氫青蒿素脂質(zhì)體的制備工藝。方法：以大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比、脂質(zhì)與藥物的質(zhì)量比、水合溶液的種類為考察因素，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)優(yōu)選制備工藝。結(jié)果：優(yōu)選的工藝為采用薄膜-超聲法，大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為5∶1，脂質(zhì)與藥物的質(zhì)量比為5∶1，以0.9%NaCl注射液為水合溶液。制得的脂質(zhì)體形態(tài)均勻，包封率＞85%。結(jié)論：該制備工藝和處方可以得到高包封率和穩(wěn)定的二氫青蒿素脂質(zhì)體。

二氫青蒿素；脂質(zhì)體；包封率；質(zhì)量評(píng)價(jià)；正交試驗(yàn)

二氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿的提取物青蒿素及其衍生物在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物和有效成分，是一種水溶性很好的青蒿素衍生物，其藥理作用強(qiáng)度是青蒿素的4～8倍。研究表明[1]，除有抗瘧活性外，DHA還可抑制細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的放射敏感性，對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞具有選擇性毒性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[2]，DHA對(duì)正常人乳腺細(xì)胞HTB125無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用，但對(duì)放射抗拒的人乳腺癌細(xì)胞系HTB27表現(xiàn)了很強(qiáng)的殺傷能力。該結(jié)果提示，DHA是一種很有前途的抗乳腺癌藥物。

DHA脂質(zhì)體將脂質(zhì)體的緩控釋作用及內(nèi)化快等特點(diǎn)集于一身，具有靶向治療效果[3]，不僅可以減少毒副作用，還可以保護(hù)DHA在到達(dá)靶細(xì)胞或靶組織之前不被體內(nèi)的活性物質(zhì)所代謝而降低抗癌活性。為此，本試驗(yàn)采用薄膜-超聲法[4]，以大豆磷脂、膽固醇為膜材，將DHA制備成脂質(zhì)體，并對(duì)其處方、工藝及有關(guān)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

RE-5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500型醫(yī)用超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Cs-15R型低溫離心機(jī)、DU-650型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)貝克曼公司）；SPM-10A型數(shù)字酸度計(jì)（浙江蕭山儀器標(biāo)準(zhǔn)件廠）。

注射用大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：060727）；膽固醇（上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)：050106）；DHA（浙江義烏高登精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：051028，純度：99.3%）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備方法選擇

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)逆相蒸發(fā)法和薄膜-超聲法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用逆相蒸發(fā)法制備的DHA脂質(zhì)體比用薄膜-超聲法制備的脂質(zhì)體包封率低。筆者為獲得較高包封率的DHA脂質(zhì)體，故選擇薄膜-超聲法。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)有關(guān)文獻(xiàn)[5]及單因素考察試驗(yàn)，確定了影響DHA脂質(zhì)體包封率的3個(gè)主要因素，即大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（A）、脂質(zhì)與藥物的質(zhì)量比（B）、水合溶液的種類（C），并選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

2.3 包封率測(cè)定

2.3.1 DHA脂質(zhì)體混懸液的制備 用薄膜-超聲法制備，按表1中的條件，處方其余各原料用量固定。精密稱取大豆磷脂、膽固醇、DHA各適量，置于圓底燒瓶中，加入3mL三氯甲烷使溶解，于40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，轉(zhuǎn)速為60r·min-1，使脂質(zhì)體在瓶?jī)?nèi)壁均勻成膜，15min后即得干燥脂膜，備用。向上述薄膜中加入20mL PBS，置于超聲清洗器中超聲40min，即得DHA脂質(zhì)體混懸液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取DHA約0.01g，置于100mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后靜置2h，制成濃度為0.101mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定 以乙醇為空白，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，同時(shí)將空白脂質(zhì)體的原料大豆磷脂和膽固醇用適量的乙醇和氯仿溶解后在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)也進(jìn)行掃描。結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在237nm波長(zhǎng)處有最大吸收，此波長(zhǎng)處大豆磷脂和膽固醇對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾，故選定237nm為測(cè)定波長(zhǎng)。DHA紫外掃描圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 DHA紫外掃描圖譜1.空白基質(zhì)；2.DHAFig 1 UV scanning spectrum of DHA 1.blank matrix；2.DHA

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、3、4、5mL，置于25mL量瓶中，加2%NaOH溶液-無(wú)水乙醇（4∶1，V/V）混合溶液至刻度，搖勻，置于60℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，取出，冷至室溫，即得濃度依次為4.04、8.08、12.12、16.16、20.20μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在237nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（X）為橫坐標(biāo)，DHA的檢測(cè)濃度（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝29.4125X－0.03973（r＝0.9997）。結(jié)果表明，DHA檢測(cè)濃度在4.04～20.20μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，在237nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別測(cè)定5次。結(jié)果，低、中、高3個(gè)濃度的樣品RSD分別為0.32%、0.59%、0.11%（n均為5），表明儀器精密度良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取處方量的大豆磷脂和膽固醇，加入DHA約0.01g，按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制備樣品6份，在237nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為99.92%，RSD＝3.72%（n＝6）。

2.3.7 包封率的測(cè)定 取適量DHA脂質(zhì)體混懸液，13000r·min-1離心20min，分別精密量取離心上清液和未離心混懸液各1mL，分別置于10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻。靜置2h后各取3mL，分別置于25mL量瓶?jī)?nèi)，用2%NaOH溶液-無(wú)水乙醇（4∶1，V/V）定容，搖勻，60℃水浴反應(yīng)30min，取出，冷至室溫，待用。分別將各組離心和未離心稀釋溶液在237nm波長(zhǎng)處以2%NaOH溶液-無(wú)水乙醇（4∶1，V/V）為空白測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得游離藥物量（W游）和藥物總量（W總），按下式計(jì)算包封率：包封率＝（W總－W游）/W總×100%。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳制備工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表3可以看出，各因素的水平變化對(duì)包封率無(wú)顯著的影響，這一結(jié)果與筆者經(jīng)單因素考察后的預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果不符，可能是由于最后的極差計(jì)算時(shí)只依賴于指標(biāo)值，一旦某點(diǎn)或某幾點(diǎn)的指標(biāo)值誤差較大，勢(shì)必會(huì)影響計(jì)算結(jié)果的可靠性，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果分析的正確性，故而需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。但由表2直觀分析可以看出，對(duì)包封率的影響因素大小依次為C＞B＞A，故暫定最優(yōu)水平搭配為A3B2C3。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選工藝制備3批DHA脂質(zhì)體，光學(xué)顯微鏡下觀察，脂質(zhì)體為粒徑較均勻的球狀或近球狀小囊泡，粒徑小而均勻。按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率。結(jié)果，平均包封率為88.47%，RSD＝0.90%（n＝3），表明在優(yōu)選的工藝下制得的DHA脂質(zhì)體包封率均在85%以上，且重現(xiàn)性較好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取制得的一批DHA脂質(zhì)體樣品，測(cè)定其包封率為90.55%，分別在4℃和室溫條件下放置24h，對(duì)其包封率的變化進(jìn)行考察。結(jié)果，DHA脂質(zhì)體在4℃條件下保存24h，包封率為90.13%；室溫下保存24h后，包封率為87.5%?？梢?jiàn)，4℃條件下保存的穩(wěn)定性高于在室溫條件下保存。

3 討論

本試驗(yàn)所用的膜材為大豆磷脂（注射用）和膽固醇，其中膽固醇的加入可調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性：一定比例的膽固醇可減小膜的流動(dòng)性，增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，從而提高包封率。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在大豆磷脂（注射用）與膽固醇質(zhì)量比為5∶1時(shí)包封率較高。

本試驗(yàn)中藥物與脂質(zhì)的質(zhì)量比也是影響脂質(zhì)體包封率的一個(gè)主要因素。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，藥物濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其包封率，隨著藥物濃度的升高，包封率先升高后降低，提示DHA脂質(zhì)體的包封率可能具有飽和性[6]。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在0.9%NaCl注射液中DHA脂質(zhì)體最穩(wěn)定，這可能是在制備DHA脂質(zhì)體時(shí)大豆磷脂的水解受緩沖液pH值的影響，與其水解速度常數(shù)有關(guān)[7]。

[1] 李 菌，周慧君.DHA可抑制K562細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（11）：1041.

[2] Singh NP，Lai H.Selective toxicity of dihydroartemisinin and holotransferrin toward human breast cancer cells[J].Life Sci，2001，70：49.

[3] 馬宏達(dá)，郭 濤.脂質(zhì)體靶向載藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2004，15（11）：697.

[4] 陸 彬.藥物新劑型與新技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：108.

[5] 郭海燕，莫穗材.脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性和包封率的影響因素[J].中國(guó)新藥雜志，2004，13（6）：498.

[6] Gulati M，Grover M，Sigh M，et al.Study of azathioprine encapsulation into liposomes[J].J Microencapsule，1998，15（4）：485.

[7] 王長(zhǎng)虹，孫殿甲.脂質(zhì)體的物理化學(xué)穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1998，33（2）：65.

Optimization of the Preparation Technology of Dihydroartemisinin Liposome by Orthogonal Test

WEN Yue，MENG De-sheng，BI Xiao-ting（Dept.of Pharmacy，Research Institute of Field Surgery，Daping Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To optimize the preparation technology of dihydroartemisinin liposome.METHODS：The preparation technology of dihydroartemisinin liposomes was optimized by orthogonal test with ratio of granulesten to cholesterol，ratio of lipid to drugs and types of aqueous solution as factors and using encapsulation efficiency as index.RESULTS：Film-ultrasound method was used to optimize the preparation method.The optimal preparation technology was as follows：ratio of granulesten to cholesterol was 5∶1，ratio of lipid to drugs was 5∶1and 0.9%NaCl injection was used as aqueous solution.Prepared liposome was uniform in shape with encapsulation efficiency more than 85%.CONCLUSION：The method can be used to prepare stable dihydroartemisinin liposome with high encapsulation efficiency.

Dihydroartemisinin；Liposome；Encapsulation efficiency；Quality evaluation；Orthogonal test

R283.69；R283

A

1001-0408（2010）43-4069-03

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物新劑型和新技術(shù)。電話：023-68757194-8014。E-mail：wmonica@163.com

#通訊作者：副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)與創(chuàng)新藥物。電話：023-68757091。E-mail：mengdes@126.com

2009-10-29

2010-06-04）