李思銀，楊亮宇，楊玉艾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種豬的高度接觸性腸道傳染病，病豬以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征[1]，俗稱冬季拉稀病。本病于1977 年由比利時(shí)的Pensaert 首先發(fā)現(xiàn)，并從病料中分離出一株不同于豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）的病毒，將其命名為類冠狀病毒（CVL）CV777 株。隨后英國(guó)、匈牙利、西德、加拿大、日本等國(guó)相繼報(bào)道有該病的發(fā)生。1982年國(guó)際病毒分類委員會(huì)將該病毒歸類為冠狀病毒屬。我國(guó)于1980 年首次分離得到PEDV，以后許多地區(qū)均報(bào)道有該病的發(fā)生。據(jù)有關(guān)部門對(duì)我國(guó)26 個(gè)省、市、自治區(qū)1987-1989 年疫病普查的不完全統(tǒng)計(jì)，在36 種豬病總死亡率中該病的死亡率占1.74%。近年來，該病的流行區(qū)域有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。

1 病原學(xué)

PEDV 為冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員，有囊膜，囊膜上有花瓣?duì)罾w突，長(zhǎng)12～24 nm，由核心向四周放射，其間距較大且排列規(guī)則，呈皇冠狀。該病毒平均直徑為130 nm（95～190 nm），在外界條件下呈球形，而在糞便中常呈現(xiàn)多種形態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)，該病毒只有一個(gè)血清型，不能凝集人、兔、豬、鼠、犬、馬、 羊、牛的紅細(xì)胞。該病毒對(duì)外界抵抗力弱，對(duì)乙醚、氯仿敏感，一般消毒藥可將其殺滅，60 ℃ 30 min，可使其失去感染力，但在4 ℃，pH 5.0～9.0、37 ℃，pH 6.5～7.5 或50 ℃條件下相對(duì)穩(wěn)定。

2 流行病學(xué)

該病僅發(fā)生于豬，各種年齡的豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，母豬的發(fā)病率在15%～90%，哺乳仔豬尤為嚴(yán)重，病死率平均為50%，成年母豬發(fā)病率10%～90%。病豬和帶毒豬是主要傳染源，被含有病毒的糞便污染的運(yùn)輸車輛、飼養(yǎng)員的鞋子或其他帶毒的動(dòng)物，均可成為本病的傳播媒介，主要通過消化道傳播，也有經(jīng)呼吸道傳播的報(bào)道。PEDV 可在豬群中持續(xù)存在，并能在豬體內(nèi)產(chǎn)生一定的免疫記憶。各種年齡的豬對(duì)該病均易感，本病多發(fā)生于冬季，12 月份至翌年2月份為本病的高發(fā)期，夏季也可發(fā)生。PEDV 可單一感染，也可與TGEV 混合感染，但以混合感染較為常見。近年來，臨床上出現(xiàn)了PEDV 與豬圓環(huán)病 毒（porcine circovirus，PCV） 混合感染的報(bào)道，但發(fā)病原因尚不明確。

3 臨床癥狀

PED 常以暴發(fā)性腹瀉的形式發(fā)生在非免疫斷奶仔豬或各種年齡的豬，主要臨診癥狀與TGE 相似，多表現(xiàn)為水樣腹瀉，糞稀如水，呈灰黃色或灰色，或于進(jìn)食或吮乳后伴發(fā)嘔吐，但程度較輕，傳播稍慢。病豬具體臨床表現(xiàn)因年齡不同而有差異，年齡越小，臨診癥狀越重。1 周齡內(nèi)新生仔豬常于腹瀉后2～4 d 內(nèi)因脫水而死亡，病死率可達(dá)50%。斷奶豬和肥育豬以及母豬常呈現(xiàn)沉郁和厭食等臨診癥狀，持續(xù)腹瀉4～7 d，逐漸恢復(fù)正常。成年豬僅表現(xiàn)沉郁、厭食、嘔吐等臨診癥狀，如果沒有繼發(fā)其他疾病并護(hù)理得當(dāng)，豬只很少發(fā)生死亡。少數(shù)病豬出現(xiàn)體溫升高1～2 ℃，精神沉郁，食欲減退或廢絕，尤其是繁殖種豬。

4 病理剖檢

該病的病理剖檢變化主要在小腸，表現(xiàn)為小腸膨脹，充滿淡黃色液體，腸壁變薄，空腸段上皮細(xì)胞的空泡形成和表皮脫落。少數(shù)病例小腸黏膜有出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)水腫，胃內(nèi)有多量的黃白色凝乳塊，其他實(shí)質(zhì)性器官無明顯病理變化。電鏡觀察可見腸絨毛萎縮，絨毛與腸腺的比率從正常的7 ∶1 降至3 ∶1[2]。

5 診斷

該病的流行病學(xué)和臨床癥狀方面與豬傳染性胃腸炎無顯著差別，只是傳播速度比較慢，無法通過臨床癥狀、流行病學(xué)和病理變化進(jìn)行確診，必須借助于實(shí)驗(yàn)室檢查方法才能確診。目前，常用的實(shí)驗(yàn)室檢查方法有病毒的分離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、免疫電鏡（IEM）、免疫熒光（FAT）、ELISA、RT-PCR 等。

5.1 病毒的分離鑒定

由于細(xì)胞培養(yǎng)液中的小牛血清會(huì)抑制PEDV 與細(xì)胞受體的結(jié)合，且胰酶有一定的耐受性，另外原代PEDV 不易在豬腎傳代細(xì)胞系（PK-15、IBRS）及非洲綠猴腎（Vero）等細(xì)胞上增殖，故該病毒很難培養(yǎng)。1982 年通過胎豬腸上皮細(xì)胞單層和胎豬小腸絨毛上皮細(xì)胞成功分離得到1 株病毒。近年來又將其適應(yīng)了Vero 細(xì)胞。也有研究表明：用含有60 μg/mL 胰酶液的細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行PEDV 傳代適應(yīng)，在第3 代就出現(xiàn)明顯的CPE，第5 代毒價(jià)可達(dá)10-7.0/0.1mL，并通過乳豬回歸試驗(yàn)和特異性中和試驗(yàn)證實(shí)所增殖的病毒為豬流行性腹瀉病毒[3]。這些病毒分離鑒定的方法對(duì)PED血清學(xué)、病原學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究提供了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)，但由于病毒的分離鑒定需要有一套成熟的細(xì)胞培養(yǎng)體系，而且PEDV需要在細(xì)胞系中連續(xù)傳代才能出現(xiàn)明顯的CPE，目前尚無法推廣應(yīng)用。

5.2 微量血清中和試驗(yàn)

林志雄等[4]利用已適應(yīng)于傳代細(xì)胞生長(zhǎng)的豬流行性腹瀉病毒PEDV-G1株，以PK-15 作指示細(xì)胞，與被檢血清進(jìn)行微量中和，測(cè)定待檢血清中的特異性抗體，48 h 進(jìn)行結(jié)果判定，證實(shí)該方法可以用來檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，具有較高的敏感性，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，并建立了PED 微量血清中和試驗(yàn)。但該方法需要標(biāo)準(zhǔn)毒株作為指示毒株和成熟的細(xì)胞培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)條件的限制因素比較多，很難在短期內(nèi)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

5.3 免疫電鏡法（IEM）

IEM 法可用已知的PEDV 高免血清檢測(cè)未知的病毒，又可用已知的PEDV 抗原檢測(cè)未知抗體。取經(jīng)濾過的腸內(nèi)容物，加等量經(jīng)過稀釋的高免血清，混合后在37 ℃條件下感作30 min，再移至4 ℃感作18 h，然后將標(biāo)本在4 ℃以31 000 r/min 離心60 min，沉淀物以少量蒸餾水懸浮后鋪在銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸負(fù)染后作電鏡觀察，如可疑病料中含有豬流行性腹瀉病毒粒子，由于抗原和抗體的特異性結(jié)合，病毒粒子呈晶格狀排列，并可見到毒粒間的抗體橋。王繼科等[5]把PEDV 的抗原和抗體分別經(jīng)10 000 r/min 離心、免疫復(fù)合物又經(jīng)12 000r/min 離心后，通過電鏡觀察到了典型的病毒粒子形成的免疫復(fù)合物，并建立了具有3 次篩選作用改良的IEM 法。該方法簡(jiǎn)便、直觀、快速、定性準(zhǔn)確，但該方法要求有價(jià)格高昂的電鏡設(shè)備，而且電鏡檢查一般需3～7 d 才能出報(bào)告，不適用于大規(guī)模臨床診斷。

5.4 免疫熒光法

試驗(yàn)研究證明，用直接免疫熒光法（fluorescent antibody technique，F(xiàn)AT）檢查病料中的豬流行性腹瀉抗原是可靠的特異性診斷方法，目前應(yīng)用最為廣泛。取病豬小腸作冰凍切片或小腸黏膜抹片，風(fēng)干后丙酮固定，加熒光抗體染色，充分水洗，封蓋鏡檢，1～2 h 即可得出結(jié)果。為了與豬傳染性胃腸炎鑒別，最好同時(shí)用豬傳染性胃腸炎熒光抗體染色檢查。崔現(xiàn)蘭等[6]對(duì)免疫熒光法用于豬流行性腹瀉的診斷進(jìn)行了大量的探索，結(jié)果表明：FAT 的檢出率為91.4%，間接免疫熒光法（IFAT）的檢出率為89%，而且比電鏡更敏感、更可靠。林志雄等[7]用適應(yīng)于Vero、PK-15 等傳代細(xì)胞株生長(zhǎng)繁殖的PEDV-G1 株建立了PEDV 的直接免疫熒光法，并與哈爾濱獸醫(yī)研究所的熒光抗體方法檢測(cè)結(jié)果相比較，陽性符合率達(dá)95%（19/20），陰性符合率90%（9/10），且與豬傳染性胃腸炎病毒、豬細(xì)小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等沒有交叉反應(yīng)，證明FAT 法用于豬流行性腹瀉的診斷具有較高的準(zhǔn)確性和特異性。由于該方法需要在病死豬只或在腹瀉早期撲殺后取腸道組織制備切片，故很難用于臨床診斷。

5.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA 試驗(yàn)可直接應(yīng)用于糞便中PEDV 的檢測(cè)，而且比電鏡更敏感、可靠，應(yīng)用較為廣泛。當(dāng)病豬一出現(xiàn)腹瀉，即可進(jìn)行檢測(cè)，甚至痊愈不久的病豬，仍可用該方法進(jìn)行檢測(cè)。陳茹等[8]用分離純化的PEDV 抗原，建立了用于檢測(cè)PEDV 抗體的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA），并對(duì)比了該方法和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的檢測(cè)情況，結(jié)果表明，Dot-ELISA 更敏感，且該法重復(fù)性較好。鄒勇等[9]用PEDV 細(xì)胞培養(yǎng)物提純的抗原，組織毒免疫獲得的高免血清建立了間接ELISA 檢測(cè)PEDV 抗體水平。結(jié)果表明：包被抗原濃度為1 ∶20000，酶標(biāo)羊抗豬IgG濃度選用1 ∶250 為測(cè)定抗PEDV IgG抗體的最適工作濃度。田間檢測(cè)結(jié)果與臨床發(fā)病和預(yù)期結(jié)果一致。韓國(guó)學(xué)者Kim O 等[10]建立了可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準(zhǔn)確而特異的檢出PEDV 的單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫組化法，該方法也可用于鑒別診斷PEDV 與TGEV。但該方法對(duì)病料的前期處理比較繁瑣。

5.6 反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR 法）

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)于PEDV 和TGEV 核酸的檢測(cè)方法越來越受到人們的重視。有研究表明，RT-PCR 法是目前鑒別診斷TGEV 和PEDV 最敏感、特異的方法。傳統(tǒng)方法診斷主要從病毒的分離與鑒定、抗原檢測(cè)、電鏡檢測(cè)、血清學(xué)診斷等方面進(jìn)行。與傳統(tǒng)方法比較，RT-PCR 方法只需要病豬的糞便即可進(jìn)行活體診斷，便于疾病的早期診斷，敏感性和特異性高，而且操作步驟更加快速、方便，一般4～6 h 內(nèi)可以提供準(zhǔn)確的結(jié)果。

Ishikawa K 等[11]根據(jù)S基因序列設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物，成功建立了可用于檢測(cè)細(xì)胞和糞便中PEDV的RT-PCR 法，此法靈敏度可達(dá)100 TCID50/mL，并可在8 h 內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果。Kubota 等[12]在N 基因的基礎(chǔ)上，也成功建立了可進(jìn)行PEDV細(xì)胞毒和糞便毒的RT-PCR 檢測(cè)方法。Kim O 等[13-14]已建立了TGEV和PEDV 的 二 聯(lián)RT-PCR 診斷方法，并對(duì)免疫組化、原位雜交、RTPCR 3 種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性最好，但當(dāng)被檢樣品為福爾馬林固定時(shí)，更適宜采用免疫組化和原位雜交法。

吳凌等[15]將豬流行性腹瀉病毒分離株HLJ02，經(jīng)過胰酶處理后，在Vero 細(xì)胞上增殖， 用RT-PCR 和RT-nested PCR 分別擴(kuò)增出854 bp的M 全基因片段和412 bp 的M 基因部分片段，而豬傳染性胃腸炎病毒和Vero 細(xì)胞培養(yǎng)液中未擴(kuò)增出上述產(chǎn)物，表明RT-nested PCR 可用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒。劉鄧等對(duì)TGEV和PEDV 的二聯(lián)RT-PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，提高了病毒感染初期的敏感性，并建立了用于檢測(cè)PEDV 的TaqMan 熒光定量RT-PCR 法，對(duì)TaqMan 熒光定量RT-PCR 法和RT-PCR 法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比和分析，結(jié)果表明普通RT-PCR 檢測(cè)PEDV 存在漏檢的可能，而TaqMan熒光定量RT-PCR 法具有準(zhǔn)確、定量、污染低、靈敏度高、特異性強(qiáng)及省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)[16，17]。但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員以及實(shí)驗(yàn)條件等的要求較為嚴(yán)格，以及檢測(cè)成本的限制，因此在推廣上仍有很大的限制。

PED 與TGE 的臨床癥狀極其相似，所以診斷非常困難。最初的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定、中和試驗(yàn)、免疫電鏡、免疫熒光等病原學(xué)診斷方法，這些方法都能對(duì)PED做出準(zhǔn)確的診斷，但是一般都只能在病豬死亡后或者早期撲殺后才能進(jìn)行，而且檢測(cè)前病料的前期處理比較繁瑣，有的甚至要求價(jià)格高昂的實(shí)驗(yàn)設(shè)備或成熟的細(xì)胞培養(yǎng)體系，操作復(fù)雜而且耗時(shí)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RTPCR 技術(shù)被應(yīng)用到PEDV 診斷技術(shù)中，雖然此法敏感性和特異性都很好，但由于需要特殊的儀器設(shè)備，目前只適用于實(shí)驗(yàn)室診斷，不適用于臨床診斷。綜合考慮，直接免疫熒光法（FAT）和ELISA 相對(duì)比較方便，而且準(zhǔn)確性比較高，目前應(yīng)用最為廣泛。

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