賈紅燕, 李輝宇, 趙浩亮

(山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院普外科, 太原 030001; *通訊作者,E-mail:haoliangzhao@hotmail.com)

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI),可引起全身多臟器功能不全,重者導致死亡,是影響疾病預后及病人生存率的重要因素之一[1]。因此,防治肝缺血再灌注損傷是處理各種嚴重肝臟疾病、提高肝移植成功率的重要措施。近年來,人們嘗試多種藥物來預防或減輕 HIRI,如心房利鈉多肽、FK506等[2],因其價格昂貴,臨床上難以推廣應用。因此尋找一種價格適中、療效滿意的藥物,以預防、減輕 HIRI。前列地爾注射液是由脂微球包裹前列地爾制成的一種穩(wěn)定劑型。本實驗通過建立犬肝缺血再灌注損傷模型,觀察了凱時對犬肝臟缺血再灌注損傷的保護作用并進一步探討其可能機制,為擴展其臨床用途提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性雜交犬,12-15月齡,體重20-25kg,由山西醫(yī)科大學動物中心提供。動物購入后常規(guī)喂養(yǎng),飼養(yǎng)在 YX型實驗動物潔凈柜中。實驗室溫度(22±2)℃,濕度 40%-60%,飼喂全價滅菌飼料,自由采食飲水。喂養(yǎng)3d,充分適應環(huán)境,然后進入實驗。血清 TNF-α檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供,凱時注射液由北京泰德制藥有限公司提供。

1.2 動物分組 24只健康雜交犬按數(shù)字順序編碼隨機分為3組:假手術組,缺血再灌注損傷組(IR組)和前列地爾預處理組(前列地爾組),每組 8只。

1.3 模型制備 參照 Hafez等[3]在犬肝缺血再灌注實驗研究中的模型制作方法,建立肝缺血再灌注模型。實驗前所有動物禁食8h,自由飲水。6.5%戊巴比妥鈉(0.5ml/kg)靜脈注射麻醉,腹正中切口入腹,游離肝十二指腸韌帶、左右三角韌帶,解剖第二肝門;然后經(jīng)門靜脈注射肝素鈉(500IU/kg體重)行肝素化后,常溫下用無損傷血管鉗先阻斷第一肝門(包括膽總管),然后阻斷第二肝門,肝臟缺血30min后解除阻斷,恢復肝臟血流,再灌注60min后關腹。肝缺血再灌注模型建立。假手術組只進行組織解剖、游離,不阻斷肝門,IR組和前列地爾組按上述方法制備模型。前列地爾組在肝臟缺血誘導發(fā)生前經(jīng)門靜脈持續(xù)泵入前列地爾注射液0.5μg/(kg·min),假手術組和IR組靜脈注射等量生理鹽水。實驗中各組犬均完成實驗,無死亡病例。

1.4 指標測定 在肝門阻斷前、缺血 30 min、再灌注60 min后,分別采集靜脈血,以全自動生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),腫瘤壞死因子(TNF-α)含量測定嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)應用 SAS13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)均以±s表示,三組之間不同時間點測量值采用重復測量的方差分析進行檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時段各組犬血清 ALT、AST的測定 與假手術組比較,肝門阻斷前,IR組及前列地爾組血清ALT、AST濃度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);缺血30 min及再灌注 60min,IR組及前列地爾組血清ALT、AST濃度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。肝門阻斷前,IR組與前列地爾組血清 ALT、AST濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);缺血 30 min及再灌注 60 min時,兩組血清 ALT、AST濃度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01,見表1)。

表1 不同時段各組犬血清ALT,AST(IU/L)的測定值比較 (±s,IU/L,n=8)Tab 1 Changes of ALT,AST in the serum of canine at different time points in 3groups (±s,IU/L,n=8)

表1 不同時段各組犬血清ALT,AST(IU/L)的測定值比較 (±s,IU/L,n=8)Tab 1 Changes of ALT,AST in the serum of canine at different time points in 3groups (±s,IU/L,n=8)

與假手術組比較,*P＜0.01;與 IR組比較,#P＜0.01

IR組 33.53±1.42 478.92±13.38 981.85±6.12 38.26±1.17 602.09±7.32 1 042.70±6.12前列地爾組 32.61±2.10 218.79±8.81*# 470.71±7.28*# 39.32±1.51 343.81±8.65*# 623.72±8.28*#

2.2 不同時段各組犬血清 TNF-α的測定 肝門阻斷前,3組血清 TNF-α濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);缺血 30 min及再灌注 60 min時,3組血清 TNF-α濃度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。肝門阻斷前,前列地爾組與 IR組血清 TNF-α濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);缺血 30 min及再灌注 60 min時,前列地爾組血清 TNF-α濃度顯著低于IR組(P＜0.01),見表2。

表2 不同時段各組犬血清 TNF-α的測定值比較 (±s,pg/ml,n=8)Tab 2 Changes of TNF-αin the serum of canine at different time points in 3 groups (±s,pg/ml,n=8)

表2 不同時段各組犬血清 TNF-α的測定值比較 (±s,pg/ml,n=8)Tab 2 Changes of TNF-αin the serum of canine at different time points in 3 groups (±s,pg/ml,n=8)

與假手術組比較,*P＜0.01;與 IR組比較,#P＜0.01

IR組 10.58±0.72 76.95±2.68* 160.39±5.87*前列地爾組 10.31±0.44 48.24±2.28*# 71.89±2.54*#

3 討論

休克、肝臟重大手術、嚴重肝外傷的處理、肝移植等常不可避免地引發(fā)肝臟缺血再灌注損傷(HIRI),可使肝代謝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高,嚴重者可導致肝功能衰竭、移植器官無功能(primary graft nonfunction,PGNF)和多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfuction syndrome,MODS)。因此,對HIRI的研究,具有重要的理論意義和臨床實用價值。

前列地爾是一種很強的擴張血管和抑制血小板聚集的活性物質(zhì),有明顯地阻止肝細胞壞死的作用,并通過穩(wěn)定溶酶體,增加細胞膜的穩(wěn)定性,還可以緩解平滑肌痙攣,使血管擴張,增加肝血流量,降低肝動脈和門靜脈壓,改善肝臟循環(huán),抑制活性氧的產(chǎn)生和免疫抑制作用,降低血清 TNF-α活性,有利于促進肝組織的修復和重建[4]。前列地爾脂微球載體制劑是根據(jù)藥物制劑傳遞系統(tǒng)理論(DDS)研究開發(fā)的具有國際領先地位的脂微球靶向制劑。其優(yōu)點是跨越生理屏障技術、控制釋放技術、靶向技術。脂微球是理想的藥物載體,攜載前列地爾可以延長循環(huán)半衰期,加強前列地爾作用的靶向性,能有效地靶向PMN、血小板及血管內(nèi)皮細胞,從而提高藥效,減少用量,減輕毒副反應,達到更好的治療效果[5]。

本實驗表明:IR組再灌注 60 min后ALT和AST明顯增高,說明肝細胞發(fā)生嚴重的損傷,而在肝缺血再灌注期間持續(xù)泵入前列地爾注射液,可以有效減少肝細胞 ALT和AST的漏出,減輕肝細胞結(jié)構的損傷。因此前列地爾注射液對缺血再灌注肝細胞有良好的保護作用。

近年來,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)在組織缺血再灌注損傷過程中特別是在細胞凋亡中的作用[6,7],也逐漸引起人們的重視。肝臟富含 TNF-α受體,是 TNF-α作用的主要靶器官[8]。TNF-α可以通過多種機制誘導肝臟缺血再灌注損傷[9,10]。肝臟缺血再灌注后,TNF-α的過度表達可引起大量肝細胞的炎性壞死,引起肝血竇微循環(huán)障礙[7]。在我們的實驗中,IR組再灌注后60 min TNF-α的過度表達說明 TNF-α直接或間接地造成了犬肝臟的缺血再灌注損傷[11]。而前列地爾組由于應用前列地爾使得 Kuffer細胞釋放 TNF-α被抑制。

本實驗我們采用了從門靜脈給藥的方式,這與文獻報道的最佳途徑是門靜脈給藥一致[1],因為從門靜脈插管給藥,經(jīng)門靜脈注入 PGE1,不經(jīng)過外周循環(huán),不會在肺內(nèi)失活,并且能直接將藥物輸達靶細胞,使藥物選擇性地在需要部位發(fā)揮作用,可減少用量,減少副作用。但該給藥方式手術操作復雜,可能會加重對犬的創(chuàng)傷,而前列地爾注射液采用了脂微球技術,大大地減少了肺滅活。因此我們認為從外周靜脈給藥也是可行和有效的。本實驗的另一個特點是前列地爾注射液給藥時間選擇在肝臟缺血誘導發(fā)生前,同時使用靜脈泵持續(xù)給藥,保證在肝臟缺血及再灌注期間維持相對恒定的肝內(nèi) PGE1血藥濃度。總之,前列地爾注射液可以防止肝臟缺血再灌注損傷,較 PGE1更具靶向性、持續(xù)性和高效性。前列地爾脂微球這種保護作用,可能為臨床缺血預處理提供一個新的藥物,具有廣闊的臨床應用前景,值得進一步研究。

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