孫莉潔 梁金鐘,2

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1,哈爾濱 150040)

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院2,哈爾濱 150076)

響應(yīng)面法優(yōu)化大豆肽與鈣離子螯合的研究

孫莉潔1梁金鐘1,2

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1,哈爾濱 150040)

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院2,哈爾濱 150076)

為優(yōu)化大豆肽 -鈣的螯合工藝,在單因素的基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)面法對大豆肽與氯化鈣的混合質(zhì)量比、水浴時間以及無水乙醇添加倍數(shù)之間的交互作用進(jìn)行試驗(yàn)探討并確立了最佳水平。研究結(jié)果表明:無水乙醇添加倍數(shù)顯著地影響了大豆肽 -鈣螯合效果,混合質(zhì)量比、水浴時間次之,優(yōu)化的最佳條件為:混合質(zhì)量比4.2∶1,水浴時間 21.3 min,無水乙醇添加 6倍,在此條件下,大豆肽 -鈣的得率為 65.4752%,鈣質(zhì)量比為7.74 g/(100 g大豆肽 -鈣產(chǎn)品)。大豆肽與大豆肽 -鈣的傅里葉變換紅外光譜對照結(jié)果顯示:在大豆肽 -鈣的螯合工藝中,氨基與羧基均參與了螯合反應(yīng)。

大豆肽 螯合鈣 工藝 響應(yīng)面法

國內(nèi)外的調(diào)查結(jié)果表明,鈣缺乏相關(guān)性疾病是長期缺鈣的結(jié)果[1]。無論是老人還是兒童,缺鈣幾乎是全球性的營養(yǎng)問題[2]。尤其對孕期婦女而言,鈣、鎂等微量營養(yǎng)素的補(bǔ)充對胎兒的生長發(fā)育非常必要[3]。因此,在提高膳食中對鈣的吸收利用率之外,尋求更高效的補(bǔ)鈣制劑亦是解決缺鈣問題的有效途徑。

國外已有學(xué)者對鈣調(diào)蛋白[4-5]和具有一定序列的肽之間的作用機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究,為我們提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。大豆肽可與鈣、鋅、銅、鎂、鐵等金屬離子和微量元素形成絡(luò)合物,保護(hù)一些金屬離子和人體所必需的微量元素不被植酸、草酸、單寧所沉淀,并使微量元素處于良好的可溶狀態(tài),有利于被機(jī)體吸收,顯著促進(jìn)鈣、磷等礦物質(zhì)和其他微量元素的吸收[6-7]。同時,大豆肽營養(yǎng)價值高,易于被人體吸收。因此,大豆肽 -鈣螯合物在理論上擁有雙重的營養(yǎng)價值:在補(bǔ)充優(yōu)質(zhì)氮源的同時,更促進(jìn)了人體對鈣質(zhì)的吸收。本試驗(yàn)采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)制得的大豆肽作為原料與氯化鈣進(jìn)行螯合,方法簡便可取,對鈣的螯合效果較好,并且改變了大豆肽的不良?xì)馕丁?/p>

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆肽粉:哈爾濱樂能生物工程有限股份公司。

無水乙醇:分析純,天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;高錳酸鉀、濃硫酸:分析純,天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;甲基紅:分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;草酸銨、無水氯化鈣:分析純,天津市博迪化工有限公司;氨水:分析純,哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司;鹽酸:分析純,哈爾濱市新達(dá)化工廠。

1.2 試驗(yàn)儀器及設(shè)備

ALC-210.2型電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;JA2003型電子天平:上海良平儀器儀表有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-3C型精密pH計:上海雷磁儀器廠;Magna-IR 560 E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀:美國尼高力 (Nicolet)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆肽 -鈣螯合工藝流程

大豆肽粉→一定量蒸餾水溶解→加入不同量的氯化鈣→調(diào)節(jié) pH→混勻→水浴并攪拌→無水乙醇沉淀→離心→沉淀洗滌→鼓風(fēng)干燥→大豆肽 -鈣

1.3.2 鈣的測定

采用高錳酸鉀滴定法[8]進(jìn)行測定。

1.3.3 鈣質(zhì)量比計算公式

KMnO4KMnO4為滴定消耗的高錳酸鉀的體積/L;MCa=40 g/mol;ms為大豆肽 -鈣的質(zhì)量/g

1.3.4 大豆肽 -鈣得率計算公式

式中:ms為大豆肽 -鈣質(zhì)量 /g;C大豆肽=50 g/L;V大豆肽為每次試驗(yàn)添加大豆肽液的體積 /L;C氯化鈣=100 g/L;V氯化鈣為每次試驗(yàn)添加氯化鈣的體積 /L。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按一定質(zhì)量比進(jìn)行混合,調(diào)節(jié) pH,充分?jǐn)嚢枋蛊浠靹?在一定溫度條件下水浴保持一定時間,隨后加入合適體積的無水乙醇,離心、鼓風(fēng)干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質(zhì)量比,通過大豆肽 -鈣得率和鈣含量兩個指標(biāo)來衡量和確定最佳的螯合工藝,并通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計。

1.3.6 大豆肽 -鈣螯合物結(jié)構(gòu)的初步分析

采用傅里葉變換紅外光譜法進(jìn)行螯合物結(jié)構(gòu)的初步分析:取少量試樣,加入 KBr做稀釋劑,在瑪瑙研缽里研磨至粒子細(xì)小而均勻,壓片成型。用傅立葉變換紅外光譜儀測試,分辨率設(shè)置為 4 cm-1,掃描次數(shù) 40次。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 大豆肽與氯化鈣的混合質(zhì)量比例對大豆肽-鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質(zhì)量比1∶1、2∶1、1∶3、1∶4、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1進(jìn)行混合 ,調(diào)節(jié)至 pH 7.0,充分?jǐn)嚢枋蛊浠靹?在 50℃下水浴保持 30 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風(fēng)干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質(zhì)量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質(zhì)量比兩個指標(biāo)來確定最佳的混合比例。

圖 1 大豆肽與氯化鈣的混合質(zhì)量比對大豆肽 -鈣得率的影響

如圖 1所示,大豆肽 -鈣得率、鈣質(zhì)量比兩組曲線的變化趨勢基本一致。當(dāng)大豆肽與氯化鈣質(zhì)量比達(dá)到4∶1時,大豆肽 -鈣得率達(dá)到最大值,此時,每100 g大豆肽 -鈣產(chǎn)品中的鈣質(zhì)量比也達(dá)到最大?？梢哉J(rèn)為,此時大豆肽與氯化鈣可以比較充分地螯合,因此選擇混合比4∶1作為最佳的混合比值。

2.1.2 pH對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質(zhì)量比4 ∶1進(jìn)行混合 ,調(diào)節(jié) pH分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,充分?jǐn)嚢枋蛊浠靹?,在 50 ℃下水浴保持 30 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風(fēng)干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質(zhì)量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質(zhì)量比兩個指標(biāo)來確定最佳的 pH。

圖 2 pH對大豆肽 -鈣得率的影響

如圖 2所示,在 pH從 1到 7的改變中,兩組曲線的變化均比較大,但基本趨勢依然一致。在酸性條件下,大豆肽會發(fā)生部分解離,使得和鈣反應(yīng)的-COO-增加,pH 5.5時達(dá)到較大值。隨著 pH的增大,解離慢慢變?nèi)?部分大豆肽通過吸附作用與鈣結(jié)合[9],從而使得大豆肽 -鈣得率在 pH 6.5時達(dá)到最大值。而在偏堿性或者堿性條件下,會產(chǎn)生Ca(OH)2,從而會影響大豆肽與鈣的螯合,因此,本試驗(yàn)不研究堿性條件下的螯合。此單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,pH 6.5可以作為后續(xù)研究的最佳參數(shù)。

2.1.3 水浴溫度對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質(zhì)量比4∶1進(jìn)行混合,調(diào)節(jié)至 pH 6.5,充分?jǐn)嚢枋蛊浠靹?分別在 30、40、50、60、70 ℃下水浴保持 30 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風(fēng)干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質(zhì)量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質(zhì)量比兩個指標(biāo)來確定最佳的水浴溫度。

圖 3 水浴溫度對大豆肽 -鈣得率的影響

從圖 3可知,兩組曲線的變化趨勢一致,而且隨著溫度的升高,均沒有大幅的變化。即說明大豆肽-鈣螯合反應(yīng)中,溫度對大豆肽 -鈣得率影響不大。在后續(xù)試驗(yàn)中,選擇 50℃作為最佳的反應(yīng)溫度。

2.1.4 水浴時間對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質(zhì)量比4∶1進(jìn)行混合,調(diào)節(jié)至 pH 6.5,充分?jǐn)嚢枋蛊浠靹?在 50 ℃下分別水浴保持 0、10、20、30、40、50 min,隨后加入 8倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風(fēng)干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽-鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質(zhì)量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質(zhì)量比兩個指標(biāo)來確定最佳的水浴時間。

圖 4 水浴時間對大豆肽 -鈣得率的影響

水浴時間對大豆肽 -鈣得率的影響如圖 4所示。由圖 4可知,在水浴時間 20 min時,大豆肽 -鈣得率和鈣質(zhì)量比均達(dá)到最大值。這是因?yàn)橥ㄟ^吸附作用而產(chǎn)生的大豆肽 -鈣隨著反應(yīng)的進(jìn)行發(fā)生著動態(tài)的吸附和解析過程,20 min時達(dá)到動態(tài)平衡。因此在后續(xù)試驗(yàn)中,選擇反應(yīng)時間 20 min作為最佳的參數(shù)。

2.1.5 無水乙醇添加量對大豆肽 -鈣得率的影響

將 50 g/L的多肽溶液與 100 g/L氯化鈣按質(zhì)量比4∶1進(jìn)行混合,調(diào)節(jié)至 pH 6.5,充分?jǐn)嚢枋蛊浠靹?在 50℃下水浴保持 20 min,隨后分別加入 4、6、8、10、12倍于混合液體積的無水乙醇,離心、鼓風(fēng)干燥得到大豆肽 -鈣,稱重。稱取 0.2～0.3 g大豆肽 -鈣按照高錳酸鉀滴定法測定其中的鈣質(zhì)量比,通過大豆肽 -鈣的得率和鈣質(zhì)量比兩個指標(biāo)來確定最佳的無水乙醇添加量。

圖 5 無水乙醇添加倍數(shù)對大豆肽 -鈣得率的影響

無水乙醇的添加量對大豆肽 -鈣得率的影響如圖 5所示。不同的乙醇添加倍數(shù)對大豆肽 -得率以及鈣質(zhì)量比的影響都比較大。當(dāng)無水乙醇體積是混合液體積的 6倍時,兩者都達(dá)到最大值。這是因?yàn)?乙醇添加量過少,沉淀不夠充分,添加量過多,又會破壞大豆肽與鈣的結(jié)合,乙醇和氯化鈣反應(yīng)生成CaCl2·4C2H5OH,因此,適當(dāng)?shù)奶砑恿繉Υ蠖闺?-鈣的影響也很大,在后續(xù)試驗(yàn)中,選擇 6倍于混合液體積的無水乙醇添加量作為最佳參數(shù)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果與分析

根據(jù) Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理[10],綜合單因素的試驗(yàn)結(jié)果,選取大豆肽與氯化鈣的混合質(zhì)量比、水浴時間、無水乙醇添加倍數(shù)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),表 1為響應(yīng)面因素水平設(shè)計。表 2為響應(yīng)面回歸試驗(yàn)設(shè)計與試驗(yàn)結(jié)果。

表 1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計

表 2 響應(yīng)面設(shè)計與試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)編號 1～12是析因試驗(yàn),試驗(yàn)編號 13～15是中心試驗(yàn)。15個試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn),其中析因點(diǎn)為自變量取值在 x1、x2、x3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)上;零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn),零點(diǎn)重復(fù) 3次,以估計試驗(yàn)誤差。應(yīng)用統(tǒng)計軟件 SAS-RSREG程序?qū)Ρ?2中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,二次多元回歸方程為:

Y=0.648 466 67+0.041 850 00x1+0.000 667 50x2+0.002 150 00x3-0.067 983 333x1x1+0.003 550 00x2x1-0.013 933 3x2x2+0.008 550 00x3x1-0.000 350 00x3x2-0.026 483 33x3x3

對該方程的方差分析結(jié)果見表 3,回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表 4,方程的驗(yàn)證結(jié)果見表 5,響應(yīng)面圖和等高線圖分別見圖 6～圖 8。

表 3 回歸方程方差分析

從表 3可以看出,用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時,各因素中一次項(xiàng)和二次項(xiàng)比較顯著,但交叉項(xiàng)不顯著。因此,各具體試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。響應(yīng)面的模型總離差平方和為 0.001 397。3個因子對 Y的效應(yīng)有一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交叉項(xiàng)。由 R=0.980 5、R2=0.961 3可以得出此模型的符合度為 96.13%,模型擬合大豆肽 -鈣螯合得率與 3個因子的關(guān)系確立。

表 4 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果

從表 4可以看出,回歸方程對試驗(yàn)擬合較好,方差分析結(jié)果較顯著,因此可用回歸方程代替試驗(yàn)值進(jìn)行分析。

表 5 方程檢驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表 5中檢驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明,P值為0.952 8,檢驗(yàn)結(jié)果與模型計算結(jié)果沒有顯著差異。

圖 6 Y=f(x1,x2)的響應(yīng)面及等高線

圖 6～圖 8反映了各因素對響應(yīng)值的影響。從等高線圖可以看出,極值條件應(yīng)在圓心處。比較 3組圖可知,無水乙醇添加倍數(shù) (x3)是影響大豆肽 -鈣得率的最顯著因素,混合比 (x1)和水浴時間 (x2)次之,說明 x1、x2對響應(yīng)值影響相對較小。

由圖 6～圖 8可以看出,大豆肽 -鈣得率隨無水乙醇添加倍數(shù)的增大而增大,而混合質(zhì)量比和水浴時間在設(shè)定的范圍內(nèi)都有一個最大值。由于無水乙醇添加量增加,無水乙醇會奪取被大豆肽結(jié)合的鈣離子重新與氯離子和乙醇形成 CaCl2·4C2H5OH的幾率增大,從而減少大豆肽 -鈣的得率,所以選擇 6倍于混合液體積的無水乙醇添加量是最適合的量;最佳混合質(zhì)量比和水浴時間可以由上述方程求導(dǎo)得到:混合質(zhì)量比為4.184∶1,水浴時間為21.287 min。由響應(yīng)面模型可得出無水乙醇添加 6倍,水浴時間21.28 min、混合質(zhì)量比4.184∶1是最佳的螯合條件。在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測的大豆肽 -鈣的得率為65.6208%。

為了驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性,采用最優(yōu)條件進(jìn)行大豆肽 -鈣的螯合?？紤]到試驗(yàn)操作的可行性,將最優(yōu)螯合條件修正為無水乙醇添加 6倍,水浴時間21.3 min、混合質(zhì)量比4.2∶1。在此條件下測得的大豆肽 -鈣得率為 65.4752%,(鈣質(zhì)量比 7.74 g/100 g大豆肽 -鈣)與理論預(yù)測值的誤差為 2.23%,說明采用 RS M法優(yōu)化得到的浸提螯合條件可靠。

2.3 大豆肽與大豆肽 -鈣紅外色譜結(jié)果

取少量試樣,加入 KBr做稀釋劑,在瑪瑙研缽里研磨至粒子細(xì)小而均勻,壓片成型。用傅立葉變換紅外光譜儀測試,分辨率設(shè)置為 4 cm-1,掃描次數(shù) 40次。圖 9為大豆肽紅外色譜圖,圖 10為大豆肽 -鈣紅外色譜圖。

圖 9和圖 10分別是大豆肽與鈣結(jié)合前后的紅外光譜圖,圖 9中 3 274 cm-1是由 N-H伸縮振動引起,而在圖 10中,此波段變?yōu)?3 376 cm-1,向高波段移動了 102個波數(shù),成為銨鹽 NH4+的特征頻率,因此可判斷,大豆肽中氨基參與了鈣的螯合;同時圖 9中 1 455 cm-1出的吸收峰在圖 10中幾乎被掩蓋,圖9中的 1 400 cm-1在圖 10中是 1 408 cm-1,向高波位移動了 8個波數(shù),成為 COO-伸縮振動引起的羧酸鹽的特征頻率[11],因此,可以判斷,羧基參與了大豆肽-鈣的螯合反應(yīng)。

3 結(jié)論

3.1 大豆肽 -鈣螯合工藝通過響應(yīng)面法優(yōu)化后,最佳的工藝參數(shù)為:大豆肽與氯化鈣的混合質(zhì)量比4.2∶1,水浴時間 21.3 min,無水乙醇添加 6倍,在此條件下大豆肽 -鈣的得率可達(dá) 65.4752%,鈣質(zhì)量比為 7.74 g/(100 g大豆肽 -鈣產(chǎn)品)。

3.2 通過紅外色譜圖可以判斷,在大豆肽 -鈣的螯合試驗(yàn)中,氨基與羧基均參與了螯合反應(yīng),關(guān)于鈣是否與大豆肽通過吸附作用結(jié)合的論斷在紅外圖譜中沒有體現(xiàn),有待進(jìn)一步考證。

[1]白建,朱迎春,梁銳萍,等.新型氨基酸螯合鈣的研制[J].食品科學(xué),2005,11:75-76

[2]楊燊,鄧尚貴,秦小明.低值魚蛋白多肽 -鈣螯合物的制備和抗氧化、抗菌活性研究[J].食品科學(xué),2008,29(1):202-206

[3]王學(xué)生,于萍,王成剛.產(chǎn)婦長發(fā)不同部位的鋅鈣鎂含量變化觀察[J].微量元素與健康研究,2002,19(2):21-22

[4]PM Bayley,W A Findlay,S R Martin.Target recognition by cal modulin:Dissecting the kinetics and affinity of interac2 tion using short peptide sequences[J]. Protein Science 1996,5:1215-1228

[5]Richard D Brokx,Hans J Vogel.Peptide and metal ion-de2 pendent association of isolated helix-loop-helix calcium binding domains:Studiesof thrombic fragmentsof cal modulin[J].Protein Science,2000,9:964～975

[6]程麗,梁金鐘.絮凝法預(yù)處理大豆蛋白活性肽發(fā)酵液的研究[J].大豆通報,2004(2):17-19

[7]梁金鐘,范洪臣,程麗,等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆蛋白活性肽的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,(1):88～92

[8]劉約權(quán),李貴深主編.實(shí)驗(yàn)化學(xué):上冊 [M].北京:高等教育出版社,1999,9:201-202

[9]祝德義,李彥春,靳麗強(qiáng),.膠原多肽與鈣結(jié)合性能的研究[J].中國皮革,2005,2,34(3):26-29

[10]費(fèi)榮昌.試驗(yàn)設(shè)計與數(shù)據(jù)處理 [M].第 4版,無錫:江南大學(xué)出版社,2001.59-63

[11]張正奇主編.分析化學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2006:265-288.

Opti mization of Chelation of Soybean Peptides with Calcium Using Response SurfaceMethod

Sun Lijie1Liang Jinzhong1,2
(College of Forest,Northeast ForestryUniversity1,Harbin 150040)
(College of Food Engineering,Harbin University of Commerce2,Harbin 150076)

To opti mum the chelation technology of soybean peptideswith calcium,based on single factor tests,the response surface method was used to investigate the interaction of soybean peptides to CaCl2ratio,water bath time and the times of absolute alcohol volume to mixed liquor volume;finally their optimum levelswere established.Re2 sults:The times of absolute alcohol volume to mixed liquor is much more i mportant than the other two factors.The optimum process parameters for the soybean peptides-calcium chelation are soybean peptides to CaCl2ratio 4.2∶1,water bath time 21.3 min,and the times of absolute alcohol volume to mixed liquor volume 6.Under the conditions the yield of soybean peptides-calcium is 65.4752%,and the calcium content of product is up to 7.74 g per 100 g soybean peptides-calcium.The comparison of Fourier transform infrared spectroscopy between soybean peptides and soybean peptides-calcium shows that both amino groups and carboxyl groups participate in the chelating reaction.

soybean peptides,sequestration calcium,technology,response surface method

TS201.2

A

1003-0174(2010)01-0022-06

2009-01-20

孫莉潔,女,1983年出生,碩士,食品科學(xué)

梁金鐘,男,1957年出生,教授,發(fā)酵工程