易紹金，李炳金，胡 凱（長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州434023）

黃原膠降解菌的篩選及紫外誘變選育

易紹金，李炳金，胡 凱（長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州434023）

從土壤中篩選出一株能以黃原膠為唯一碳源的黃原膠降解菌（XDB－1菌株），研究表明該菌株能在36h內(nèi)將黃原膠的粘度降至最低（＜5mPa·s）。對該菌株進行不同強度（時間）的紫外誘變，以提高菌株降解黃原膠的性能，最終選育出一株更高效的黃原膠降解菌（XDB－2菌株），紫外誘變后的菌株（XDB－2菌株）能在24h內(nèi)使黃原膠的粘度降至最低（＜5mPa·s）。

黃原膠降解菌；降粘；紫外誘變；篩選

黃原膠是由野油菜黃單孢菌分泌的中性水溶性多糖，其工業(yè)產(chǎn)品外觀為淡褐黃色粉末狀固體。由于黃原膠具有獨特的剪切稀釋性質(zhì)、良好的增粘性、理想的乳化穩(wěn)定性，對酸、堿、熱、反復凍融的高度穩(wěn)定性以及對人體的完全無毒無害等許多優(yōu)良的特性，使其在石油、食品、醫(yī)藥、日用化工等十幾個領(lǐng)域有著極其廣泛的應用［1］。超乎尋常的穩(wěn)定性極大地擴展了黃原膠的應用范圍，但同時在應用中也存在一些問題。在鉆井、壓裂施工完成后，其中所含的增粘劑——黃原膠，必須及時降解破膠，以防止堵塞油層而影響油氣生產(chǎn)。而常用的化學破膠方法雖然能降解黃原膠，但低溫破膠效果差，同時存在安全、環(huán)保隱患。筆者從土壤中篩選出一株可有效降解黃原膠的菌株，并對其進行紫外誘變選育以獲得更為高效的菌株，為鉆井、壓裂過程中黃原膠的生物破膠奠定了基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 菌種來源

試驗菌種來自與黃原膠長期接觸的土壤，以工業(yè)黃原膠為唯一碳源，經(jīng)常規(guī)分離得到［2，3］。

1.2 培養(yǎng)基

選擇性培養(yǎng)基［4］：K2HPO4·3H2O（1.0g）＋K2H2PO4（1.0g）＋NH4NO3（1.0g）＋黃原膠（5.0g），定容至1L，調(diào)pH值為7.0；121℃滅菌18min。

平板培養(yǎng)基［5］：黃原膠（3.0g）＋酵母浸膏（1.0g）＋蛋白胨（1.0g）＋葡萄糖（1.0g）＋瓊脂（20.0g），定容至1L，調(diào)pH 值為7.0；115℃滅菌20min。

基礎(chǔ)培 養(yǎng) 基［2］：K2HPO4·3H2O（1.0g）＋ K2H2PO4（1.0g）＋ NH4NO3（1.0g）＋ NaCl（5.0g）＋MgSO4·7H2O（0.2g）＋黃原膠（5.0g）＋無水CaCl2和FeCl3（微量），定容至 1L，調(diào)pH值為7.0；121℃滅菌18min。

試驗中若無特殊說明，所涉及的液體培養(yǎng)基均為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

黃原膠降解菌計數(shù)法［5］：試驗采用濁度法間接反映黃原膠降解菌的濃度，即測定黃原膠溶液在600nm處的吸光值（OD600）。OD600的大小與細菌濃度的高低呈正比例關(guān)系，OD600值越大，表明細菌濃度越高；OD600值越小，表明細菌濃度越低。

黃原膠溶液粘度測定方法［6］：采用ZNN－D6A型六速旋轉(zhuǎn)粘度儀測定25℃時的黃原膠溶液粘度。

2 黃原膠降解菌的篩選

2.1 黃原膠降解菌的分離、篩選

經(jīng)常規(guī)分離得到一組能以黃原膠為唯一碳源并使其粘度降低的細菌——黃原膠降解菌，選擇降解速度最快、降粘效果最好的菌株進行試驗。試驗步驟如下：①配制選擇性培養(yǎng)基，在250ml的三角錐形瓶中裝入100ml，滅菌后，將所采集的與黃原膠長期接觸的土樣取10g，研細后分別加入上述10個錐形瓶中，攪拌使土樣懸浮均勻，在30℃、120r/min的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，觀察黃原膠粘度變化；②當黃原膠的粘度明顯降低后，取1ml混合液，按1∶10的比例進行梯度稀釋，將稀釋好的菌液按1ml的量加入到滅菌的平板培養(yǎng)皿中，在30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，長出單個菌落；③挑取單個菌落分別接種于液體培養(yǎng)基中，在30℃、120r/min的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基粘度變化；④選取黃原膠粘度降低（＜5mPa·s）最快的一株菌種（該菌株命名為XDB－1菌株）進行菌種保藏，并進行后續(xù)試驗。

2.2 黃原膠降解菌的生長及降粘效果

將XDB－1菌株按5%的接種量接種到黃原膠液體培養(yǎng)基中，置于30℃、120r/min的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每隔一段時間測定其粘度和OD600值，得到粘度和OD600的變化曲線如圖1所示。

圖1 XDB－1菌株對黃原膠粘度及溶液OD600的影響

由圖1可以看出，開始階段（前12h）XDB－1菌液濃度幾乎沒有變化，12h后菌濃度迅速增大，48h菌濃度趨于穩(wěn)定，48～72h，菌濃度幾乎不變，之后菌濃度逐漸降低。而黃原膠粘度在前12h幾乎沒有變化，12～36h之間粘度迅速降至最低（＜5mPa·s）；之后則幾乎沒有變化。這表明，黃原膠粘度的降低與XDB－1菌株的生長基本同步，黃原膠粘度的降低是XDB－1菌株的作用所致。

3 黃原膠降解菌的紫外誘變選育

3.1 誘變選育的目的

由于篩選出的XDB－1菌株對黃原膠的作用時間相對較長，在油田實際應用中還存在一定的局限。試驗試圖通過紫外誘變，篩選出能在更短時間內(nèi)能有效降解黃原膠的菌株［7］。

3.2 紫外誘變選育方法

紫外誘變選育的方法如下：①將篩選出的XDB－1菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h后，按1∶10的比例進行梯度稀釋，將稀釋好的菌液按1ml的量加入到滅菌的培養(yǎng)皿中，然后分別在紫外燈（15W，20cm）下暴露0.5、1、2、3、5和10min。將經(jīng)過紫外線照射的培養(yǎng)皿按常規(guī)方法涂黃原膠平板，放入30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②待平板培養(yǎng)48h后，分別挑出其中形狀不同的菌落的一部分接種于黃原膠斜面培養(yǎng)基，在30℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h長出菌苔，置于冰箱保存；另一部分接種于液體培養(yǎng)基，在30℃、120r/min的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基粘度變化。③選取黃原膠粘度降低（＜5mPa·s）最快的一株菌（該菌株命名為XDB－2菌株）進行菌種保藏，并進行后續(xù)試驗。

3.3 選育菌株的生長及降粘效果

將誘變后的XDB－2菌株按5%的接種量接種到黃原膠液體培養(yǎng)基中，置于30℃、120r/min的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，間隔一段時間測定其粘度和OD600值，得到粘度和OD600的變化曲線如圖2所示。

圖2 XDB－2菌株對黃原膠粘度及OD600的影響

由圖2可以看出，開始階段（前8h）XDB－2菌液濃度幾乎沒有變化，8～32h菌濃度迅速增大，32h后菌濃度幾乎不變，48h菌濃度逐漸降低。而黃原膠粘度在前8h幾乎沒有變化，8～24h之間粘度迅速降至最低（＜5mPa·s），之后粘度幾乎沒有變化。這表明，黃原膠粘度的降低與XDB－2菌株的生長基本同步，黃原膠粘度的降低是XDB－2菌株的作用所致。對比圖1、圖2可以看出，誘變前后細菌在黃原膠液體培養(yǎng)基中都能很好地生長，但與誘變前的XDB－1菌株相比，誘變后的XDB－2菌株降解黃原膠的速度明顯加快（從36h縮短為24h）。

4 結(jié) 論

1）黃原膠作為一種生物聚合物，具有可生物降解性，能從自然界中篩選出有效降解黃原膠的細菌，這為黃原膠生物破膠提供了可能。

2）通過室內(nèi)試驗篩選出一株能有效降解黃原膠的細菌（XDB－1菌株），試驗表明它能在36h內(nèi)將黃原膠液體培養(yǎng)基的粘度降至最低（＜5mPa·s）。而通過進一步的紫外誘變，篩選出一株能在24h有效降解黃原膠使其粘度降至最低（＜5mPa·s）的菌株（XDB－2菌株）。與XDB－1菌株相比，XDB－2菌株使黃原膠降粘所需時間由36h縮短為24h。這對于加快黃原膠的生物降解，進而應用于含黃原膠的鉆井液、壓裂液的低溫生物破膠，具有重要意義。

［1］易紹金，佘躍惠.石油與環(huán)境微生物技術(shù)［M］.武漢：中國地質(zhì)大學出版社，2002.204～216.

［2］易紹金，熊漢輝，王豐.黃原膠降解菌的生長規(guī)律及影響因素［J］.鉆井液與完井液，2007，24（6）：69～71.

［3］熊漢輝，易紹金，王豐.黃原膠降解菌的降粘作用研究［J］.鉆井液與完井液，2007，24（5）：62～64.

［4］Cadmus M C，Jackson L K，Burton K A，et al.Biodegradation of xanthan gum by Bacillus sp［J］.Applied and Environmental Microbiology，1982，44（2）：5～11.

［5］韓秋惠，李沖偉，王梅，等.新分離M icrobacteriumsp.XT11菌產(chǎn)黃原膠降解酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化研究［J］.生物技術(shù)通報，2006，（增刊）：469～475.

［6］黃成棟，王洪榮，白雪芳，等.黃原膠降解菌的篩選及其降解酶性質(zhì)的研究［J］.微生物學通報，2005，32（1）：32～37.

［7］郭繼平，馬鶯.紫外誘變選育米曲霉高產(chǎn)蛋白酶菌株［J］.微生物學通報，2007，34（2）：246～250.

Selection and Ultraviolet Mutagenesis of Xanthan－degrading Bacterial

YI Shao－jin，LI Bing－jin，HU Kai（College of Chemistry and Environmental Engineering，Yangtze University，Jingzhou434023，Hubei，China）

A bacterium（XDB－1strain）which could degrade xanthan gum effectively was selected from soil.The research shows that this xanthan－degrading bacterial can take xanthan gum as the only carbon source.The bacterial can reduce the viscosity of xanthan fluid to the lowest level（＜5mPa·s）within 36hours.Also，place the bacterial under ultraviolet ray to improve its xanthan－degrading activity.Ultimately，the most effective bacterium（XDB－2strain ）is selected.Within 24hours，the xanthan－degrading bacterial after mutagenesis can reduce the viscosity of xanthan fluid to the lowest level（＜5mPa·s）.

xanthan－degrading bacterial；viscosity reduction；ultraviolet mutagenesis

TE357.9

A

1000－9752（2010）05－0118－03

2010－01－11

教育部重點實驗室資助項目（K200610）。

易紹金（1963－），男，1984年大學畢業(yè)，教授，現(xiàn)主要從事石油與環(huán)境微生物和油氣田環(huán)境保護教學與科研工作。

［編輯］ 蕭 雨