杜迎春,白春生,賈 斌,沈曉莉,申 紅,蔣 松

2.新疆農(nóng)一師五團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作站,阿克蘇 843015;

3.四川巨星集團(tuán)公司成都市 610000

細(xì)粒棘球蚴病(Cystic Echinococcosis,C.E)又稱包蟲病,是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus,E.g)的幼蟲(續(xù)絳期)寄生在各種中間宿主(人和食草動(dòng)物如牛、羊)的肝臟、肺臟等器官內(nèi)發(fā)育為包囊引起的一種人畜共患病。綿羊是細(xì)粒棘球絳蟲最適宜的中間宿主,在中國西部牧區(qū),綿羊包蟲病已經(jīng)嚴(yán)重地影響了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和農(nóng)牧民生活質(zhì)量的提高。包蟲在宿主體內(nèi)經(jīng)過了長期適應(yīng)過程,可從宿主體內(nèi)攝取營養(yǎng)而生存,并且基本上與外界環(huán)境隔絕,具有擾亂或逃避宿主機(jī)體免疫反應(yīng)的能力,因此包蟲病的免疫學(xué)研究仍然是目前的研究熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)以中國美利奴羊(新疆軍墾型)為中間宿主,檢測宿主在人工感染細(xì)粒棘球絳蚴的不同時(shí)期感染羊和未感染羊免疫指標(biāo)的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 2歲健康雌性中國美利奴羊(新疆軍墾型)14只,體重40-50kg,購自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)九師165團(tuán)。預(yù)飼期進(jìn)行包蟲病ELISA血清學(xué)檢測,確保試驗(yàn)綿羊沒有感染包蟲病,預(yù)飼7d后進(jìn)行人工感染。

1.2 細(xì)粒棘球絳蟲 從感染細(xì)粒棘球蚴病的試驗(yàn)犬體內(nèi)分離。

1.3 主要試劑和儀器 綿羊包蟲病ELISA診斷試劑盒(深圳康百得公司)。綿羊抗體和IFN-γ檢測試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。CD4單克隆抗體(MOUSE ANT I OVINE CD4：FITC),CD8單克隆抗體(MOUSE ANTI OVINECD8：RPE),CD45R單克隆抗體(MOUSE ANTIOVINE CD45R：FITC)均為Caltag Laboratories公司產(chǎn)品。溶血?jiǎng)?購自德國Partec公司。流式細(xì)胞儀為德國Partec公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 包蟲病ELISA血清學(xué)檢測 按試劑盒說明操作,確保試驗(yàn)羊均健康。

1.4.2 細(xì)粒棘球絳蟲分離 試驗(yàn)前,試驗(yàn)犬用吡奎酮和丙硫苯咪唑驅(qū)蟲(用量10mg/kg),然后注射地噻米松降低其免疫力,用患細(xì)粒棘球蚴病羊的肝臟飼喂試驗(yàn)犬,連續(xù)飼喂7d,60d后檢測到糞便有細(xì)粒棘球絳蟲卵排出者為試驗(yàn)犬感染了包蟲病。將感染包蟲病的試驗(yàn)犬麻醉、宰殺,從犬的小腸前段(主要是十二指腸和空腸前段)絨毛內(nèi)分離細(xì)粒棘球絳蟲,挑出帶有成熟孕節(jié)的蟲體(蟲體長3～8mm,一般由3個(gè)或4個(gè)體節(jié)組成,最多含有7個(gè)體節(jié),頭部呈梨形,端部略窄,上具頂突和4個(gè)吸盤,頂突有兩排約28～50個(gè)小鉤,末端體節(jié)為孕卵節(jié)片。)顯微鏡下分離計(jì)數(shù)。

1.4.3 人工感染 用注射器將10個(gè)成蟲孕節(jié)直接注射到綿羊食管中,用生理鹽水反復(fù)注射2次,確保孕節(jié)不遺留在注射器內(nèi)。

1.4.4 人工感染前7d(-7d)、感染當(dāng)天(0d)、感染后7d、21d、30d、60d采集綿羊新鮮的抗凝血和全血,分離血清。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)宰殺綿羊進(jìn)行病理剖檢。

1.4.5 淋巴細(xì)胞亞群的檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.6 血清中 IgG、IgM、IgE、IFN-γ檢測 用ELISA試劑盒檢測。

1.4.7 血液中粒細(xì)胞計(jì)數(shù)用瑞氏染色法。

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件單因素方差分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 攻蟲結(jié)果 試驗(yàn)羊人工感染細(xì)粒棘球絳蚴后第60d,宰殺進(jìn)行病理剖檢。剖檢以肝臟表面有明顯細(xì)粒棘球蚴囊腫突起、鏡檢囊液有棘球砂者判定為人工攻蟲感染為陽性。結(jié)果,人工感染的14只綿羊中8只感染,6只未感染。

2.2 淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果 CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在攻蟲后第7d、30d未感染組顯著高于感染組(P＜0.05)。未感染組的CD8+T細(xì)胞在攻蟲后第7d顯著高于攻蟲前第7d(P＜0.05);CD4+/CD8+比值和B淋巴細(xì)胞兩組之間差異不顯著(P＞0.05),見表1。

表1 外周血中CD4+T、CD8+T、B淋巴細(xì)胞和CD4+T/CD8+T比值變化Table 1 Changes of CD4+T,CD8+T,B lymphocyte and CD4+/CD8+ratio in the peripheral blood

2.3 血清中抗體檢測結(jié)果 IgG水平在攻蟲后第30d未感染組顯著高于感染組(P＜0.05),感染組IgG水平在攻蟲后第7d極顯著高于攻蟲0d(P＜0.01);感染組IgM 水平在攻蟲后第7d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05);IgE水平在攻蟲后第30d未感染組顯著高于感染組(P＜0.05),感染組IgE水平在攻蟲后第 7d達(dá)到峰值,顯著高于攻蟲0d(P＜0.05),之后開始下降,攻蟲后第60d顯著低于攻蟲后第7d(P＜0.05);未感染組IgE水平在攻蟲后第30d達(dá)到峰值,顯著高于攻蟲當(dāng)天(P＜0.05),下降緩于感染組,并維持在較高水平,攻蟲后第60d顯著低于攻蟲后第30d(P＜0.05);未感染組IFN-γ水平在攻蟲后第21d、30d顯著高于感染組(P＜0.05),見表2,3。

表2 血清中IgG和IgM變化Table 2 Changes of IgG and IgM in the blood serum

表3 血清中IgE和 IFN-γ變化Table 3 Changes of IgE and IFN-γin the blood serum

2.4 血液中粒細(xì)胞檢測結(jié)果 感染組與未感染組的白細(xì)胞水平無顯著差異,但是攻蟲0d與攻蟲前-7d比較有顯著的下降。末感染組在攻蟲后第21d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05);淋巴細(xì)胞在攻蟲后第21d(P＜0.01)、30d(P＜0.05)未感染組顯著高于感染組;嗜中性粒細(xì)胞在攻蟲后21d感染組極顯著高于未感染組(P＜0.01),見表4。

表4 外周血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞細(xì)胞變化Table 4 Changes of Leukocyte,Lymphocyte and Neutrophil in the peripheral blood

3 討 論

在寄生蟲感染中,宿主的年齡、性別和生理學(xué)狀態(tài)都可能影響宿主先天的易感性或抵抗力〔1〕。此外,用細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵或六鉤蚴感染小鼠的感染性試驗(yàn)顯示易感性會(huì)隨不同品系的小鼠種類改變〔2〕。本研究中對(duì)在相同生理狀態(tài)下的14只同一品種的中國美利奴羊進(jìn)行人工攻蟲,結(jié)果顯示8只感染,6只未感染。通過分析感染羊和未感染羊的T淋巴細(xì)胞亞群,發(fā)現(xiàn)未感染綿羊的CD4+T細(xì)胞水平在攻蟲后第7d、30d顯著高于感染羊(P＜0.05),這提示綿羊的CD4+T細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染過程中有一定的免疫保護(hù)作用,可以提高宿主對(duì)細(xì)粒棘球蚴的抵抗力。Gill等〔3〕發(fā)現(xiàn),CD4+T細(xì)胞在美利奴羊的抗蠕蟲感染中也起重要作用。在寄生蟲感染的免疫應(yīng)答中,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)性免疫主要與CD4+T細(xì)胞亞群及產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)。CD4+T細(xì)胞除識(shí)別與MHCII類分子結(jié)合的外源性抗原外,還可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體,發(fā)揮體液免疫功能,對(duì)CD8+T細(xì)胞也有重要的輔助和調(diào)節(jié)作用,而且也通過自身分泌很多重要的細(xì)胞因子,直接參與細(xì)胞免疫反應(yīng),所以CD4+T細(xì)胞是主要誘導(dǎo)群,可以啟動(dòng)和參與免疫應(yīng)答,在免疫應(yīng)答中處于核心地位〔4〕。CD8+T細(xì)胞識(shí)別與MHCI類分子結(jié)合的內(nèi)源性抗原,而黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)MHCI類抗原復(fù)合物,因此,黏膜上皮細(xì)胞可充當(dāng)抗原遞呈細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞常與蟲體感染上皮細(xì)胞直接接觸,感染的上皮細(xì)胞就成為細(xì)胞毒性T細(xì)胞的靶細(xì)胞,通過釋放穿孔素和淋巴毒素來溶解和破壞靶細(xì)胞而發(fā)揮殺傷效應(yīng)。CD4+/CD8+的比值可以反映機(jī)體內(nèi)的免疫過程,CD4+/CD8+比值上升機(jī)體呈保護(hù)性免疫,反之,則呈損傷性免疫。CD4+T細(xì)胞作為調(diào)節(jié)細(xì)胞,主要是啟動(dòng)免疫應(yīng)答和控制初次感染;CD8+T淋巴細(xì)胞作為一種效應(yīng)細(xì)胞,是抵抗再感染的主力,二者分工不同,但又密不可分。

B淋巴細(xì)胞水平對(duì)體液免疫中抗體的產(chǎn)生很重要,體液免疫中抗體的產(chǎn)生是B細(xì)胞激活和分化的結(jié)果,而B細(xì)胞的激活和分化往往需要T細(xì)胞的協(xié)助,抗體是免疫細(xì)胞被抗原激活之后的一種產(chǎn)物。本研究中攻蟲后第30d未感染羊的IgG和IgE水平顯著高于感染羊(P＜0.05),結(jié)果說明綿羊體內(nèi)IgG和IgE水平升高機(jī)體對(duì)細(xì)粒棘球蚴的抵抗力增強(qiáng)。感染羊IgM水平在攻蟲后第7d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05),這與 Wenbao Zhang〔5〕等報(bào)道的棘球蚴感染早期就可檢測到IgM的結(jié)果一致。IFN-γ是由抗原誘生的Th1型細(xì)胞因子,在抗寄生蟲感染的防御機(jī)制中主要通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能和限制細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲的增殖發(fā)育等方式控制感染。IFN-γ可促進(jìn)Th1細(xì)胞成熟,通過激活巨噬細(xì)胞殺傷蟲體、抑制包蟲組織的生長,試驗(yàn)中IFN-γ水平在攻蟲后第21d、30d未感染羊顯著高于感染羊(P＜0.05),表明綿羊體內(nèi)IFN-γ水平升高對(duì)細(xì)粒棘球蚴的抵抗力顯著增強(qiáng)。

由于寄生蟲感染會(huì)引起顯著的細(xì)胞炎性反應(yīng),本研究分析了細(xì)粒棘球蚴感染中各種粒細(xì)胞的變化。感染羊的白細(xì)胞水平在攻蟲后第21d顯著高于攻蟲0d(P＜0.05),說明細(xì)粒棘球蚴感染后白細(xì)胞會(huì)大量增殖來抵抗感染。未感染羊的淋巴細(xì)胞在攻蟲后21d、30d顯著高于感染羊,說明淋巴細(xì)胞在抗感染的寄生蟲免疫中起重要作用。張琰報(bào)道綿羊在感染細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵后25～30d,與抗體有關(guān)的嗜中性粒細(xì)胞可殺死細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵。感染羊嗜中性粒細(xì)胞在攻蟲后第21d時(shí)顯著高于未感染羊,可能與這種殺傷機(jī)制有關(guān)。

〔1〕Rickard MD,Williams JF.Hydatidosis/cysticercosis：immune mechanisms and immunization against infection〔J〕.Adv.Parasitol,1982,21：229 296.

〔2〕Dempster RP,Berridge MV,Harrison GB,et al.Echinococcus granulosus：development of an intermediate host mouse model for use in vaccination studies 〔J〕.Int J Parasitol,1991,21：549-554.

〔3〕Gill HS.Cell-mediated immunity in Merino lambs with genetic resistance to Haemonchus contortus〔J〕.Int J Parasitol,1994,24：749-756.

〔4〕Rothw EL,Gramzinski RA,Elaine R,et al.Avian Coccidisis：Changes in intestinal lymphocy te populations associated with the development of immunity toE.maxina〔J〕.Parasite Immunology,1995,l7：525-533.

〔5〕Zhang WB,Li J,Mcmanus DP.Concepts in immunology and diagnosis of hy datid disease〔J〕.Clinical Microbliology Reviews,2003,16(1)：18-36.