黃學(xué)勇,許汴利,段廣才,范清堂,郗園林

2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室,鄭州450001;

3.河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450052

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是上消化道疾病的主要致病菌,呈世界性流行危害嚴(yán)重〔1-2〕。發(fā)展疫苗是預(yù)防H.pylori感染最有效、最有前景的方法〔3〕。黏附素基因hpaA為H.pylori所特有,存在于所有菌株中,編碼相對(duì)分子質(zhì)量為30 000的蛋白質(zhì),是與宿主細(xì)胞特異性受體結(jié)合的亞單位,具有黏膜結(jié)合特性,并具有良好的抗原性和免疫原性〔4〕。本研究?jī)?yōu)化表達(dá)和純化獲得高純度的HpaA重組蛋白,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究其抗原性和免疫保護(hù)效果,為研制H.pylori的疫苗提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 幽門螺桿菌黏附素hpaA基因表達(dá)工程菌 TB1(pMAL-c2X-hpaA)由本研究室構(gòu)建并保種〔5〕,H.py lori標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性昆明小鼠90只,8 w齡,體重16～20 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,飼養(yǎng)控制條件為清潔級(jí)。UreB蛋白和佐劑mLT63本研究室制備保存。

1.2 HpaA重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 取菌種TB1(pMAL-c2X-hpaA)劃線涂布于含氨芐青霉素(100 μ g/mL)LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16 h。挑選單菌落,接種于5 mL含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液試管中,37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h,成為活化種子。以1%種量接種于200 mL LB培養(yǎng)液中,37℃、240 r/min搖床培養(yǎng)2 h(A600nmOD≈0.5),加入終濃度為0.3 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)4 h。取1 mL菌液樣品,8 000 g離心5 min,棄上清,加入 100μ L上樣緩沖液,100℃水浴6 min,取10 μ L上清加樣,進(jìn)行凝膠電泳,考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.3 菌體的收獲、超聲破碎和蛋白純化 將誘導(dǎo) TB1(pMAL-c2X-hpaA)菌液200 mL分裝,4℃,8 000 g離心20 min,棄上清,-20℃凍存過(guò)夜,PBS洗沉淀1次,收集菌液于1個(gè)離心管,重懸于 20 mL Coloun buffer中,冰水浴中超聲破碎,500 Hz,超聲10 s,間隔10 s,共30次,4℃8 000 g離心30 min,取超聲上清通過(guò)Amyloss樹脂預(yù)裝柱純化目的蛋白(按使用說(shuō)明操作),紫外分光光度計(jì)和凝膠成像系統(tǒng)分析測(cè)定樣品蛋白含量。

1.4 小鼠血清制備和ELISA檢測(cè)重組蛋白免疫小鼠血清

純化HpaA蛋白用生理鹽水稀釋成濃度為20 μ g/100 μ L,取1 mL稀釋蛋白與 1mL弗氏完全佐劑混勻,進(jìn)行超聲乳化,制備初次免疫抗原;與1 mL弗氏不完全佐劑混勻制備加強(qiáng)免疫抗原。選擇8 w齡的昆明小鼠10只,第1 w,每只小鼠背部皮下3點(diǎn)和腹腔1點(diǎn)注射初次免疫抗原200 μ L(約含融合蛋白20μ g),分別在第2～4 w以同樣的免疫方式注射加強(qiáng)免疫抗原200 μ L各1次,末次免疫后1 w,摘眼球取血,分離血清,-20℃保存。同時(shí)各選擇10只小鼠按上述免疫程序分別注射生理鹽水和弗氏佐劑作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

包被緩沖液稀釋純化HpaA重組蛋白濃度約為0.5μ g/mL,包被96孔酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜,PBS洗滌 3次。每孔加封閉液200μ L,37℃封閉2 h,PBST洗滌3次。小鼠抗血清用封閉液1∶100稀釋,PBS作為空白對(duì)照,每孔加100 μ L,37℃孵育2 h,洗滌3次。每孔加100μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(稀釋度 1∶1 000)37℃孵育 1.5 h,洗滌3次。立即加入新鮮配制的底物液 200 μ L,室溫反應(yīng)15 min,加終止液50μL,酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定每孔的吸光度值(OD值)A450nm,空白孔調(diào)零。每個(gè)血清標(biāo)本做2次,取平均值作為結(jié)果,同時(shí)檢測(cè)生理鹽水和弗氏佐劑實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

1.5 重組蛋白Western blot鑒定 純化樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳后,凝膠和硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15 min,于半干式電轉(zhuǎn)印儀中20 V轉(zhuǎn)印40 min。硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入封閉液封閉后,與一抗(本研究制備小鼠HpaA免疫血清或H.pylori全菌免疫血清)反應(yīng)2 h,洗膜后,與二抗(羊抗鼠抗體)反應(yīng)1 h,DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色,同時(shí)以正常小鼠血清為對(duì)照。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、免疫和攻擊方案 60只實(shí)驗(yàn)小鼠,隨機(jī)分成4組,每組 15只,A組(HpaA+mLT63組)：經(jīng)口灌胃 HpaA+mLT63 200 μL/只/次,含 HpaA 抗原 40 μ g,佐劑 10 μ g;B組(UreB+mLT63組)：經(jīng)口灌胃 UreB+mLT63 200 μ L/只/次,含 UreB 抗原 40μ g,佐劑 10 μ g;C 組(黏膜佐劑mLT63對(duì)照組)：經(jīng)口灌胃mLT63 200 μ L/只/次,含黏膜佐劑mLT63 10 μ g;D組(PBS對(duì)照組)：經(jīng)口灌胃 PBS 200 μ L/只/次。免疫接種前禁食12 h,禁水4 h,先用100 μ L/只3%NaHCO3灌胃中和胃酸,1 h后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別按上述免疫方案,在實(shí)驗(yàn)開始的第0、7、14、21 d各灌胃免疫1次,灌胃后4 h解除禁食、禁水。在末次免疫后1 w,各組均用新鮮培養(yǎng)的H.py lori國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637進(jìn)行攻擊感染,每只小鼠經(jīng)口灌胃H.pylori菌液200μ L,約含H.pylori菌體2×108CFU,間隔10 h,再攻擊1次,末次攻擊4 h后恢復(fù)食水。在攻擊感染2 w后處死實(shí)驗(yàn)小鼠。

1.7 細(xì)菌的定植評(píng)價(jià)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在H.pylori攻擊感染2 w后,處死小鼠,解剖取出胃體,沿胃大彎縱向切開,用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物,將胃組織沿胃小彎剪切成兩份,一份放入10%福爾馬林固定備組織學(xué)檢查,另一份再分為3份,分別用于尿素酶試驗(yàn)、涂片Giemsa染色、H.pylori培養(yǎng)試驗(yàn)。應(yīng)用SAS 9.13統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 HpaA重組蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果 將重組菌TB1(PMAL-c2X-hpaA)和對(duì)照菌TB1(PMAL-c2X)誘導(dǎo)后的粗提蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,發(fā)現(xiàn)重組細(xì)菌在相對(duì)分子量71 500處出現(xiàn)一條特異蛋白帶,正好是標(biāo)簽蛋白MBP(相對(duì)分子量42 500)與HpaA的相對(duì)分子量(29 000)的總和,與預(yù)期融合蛋白相對(duì)分子量相符。同時(shí)純化樣品10 μ L進(jìn)行SDS-PAGE電泳,凝膠成像系統(tǒng)分析和紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品蛋白濃度約為0.138 mg/mL,純度大于90%,見圖1。

圖1 TB1(pMAL-c2X-hpaA)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和純化樣品的SDS-PAGE分析1：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);2：TB1(pMAL-c2X)表達(dá)產(chǎn)物;3：TB1(pMA L-c2X-hpaA)表達(dá)產(chǎn)物;4：純化的 HpaA重組蛋白Fig.1 SDS-PAGE analysis of products of induced TB1(pMAL-c2X-hpaA) and identification of purified HpaA1：Lower protein molecular weight marker;2：TB1(pMAL-c2X)induced;3：TB1(pMAL-c2X-hpaA)induced;4：purified HpaA by amyloss pre-packed column.

2.2 ELISA法檢測(cè)純化重組蛋白免疫活性結(jié)果10只注射生理鹽水小鼠血清OD值的平均值=0.2248)加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(s=0.0619)為判斷臨界值±3s=0.4105),即截?cái)嘀?Cut-off值),高于此值為陽(yáng)性,低于此值為陰性。生理鹽水和弗氏佐劑作實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)血清OD值大于0.4105實(shí)驗(yàn)小鼠,而HpaA純化重組蛋白免疫組中10只實(shí)驗(yàn)小鼠血清OD值均大于0.4105,全部小鼠可以檢測(cè)到免疫血清抗體,說(shuō)明重組蛋白具有良好的免疫原性。

2.3 純化目的蛋白Western blot結(jié)果 純化目的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,半干式電轉(zhuǎn)儀中將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,以小鼠HpaA免疫血清(或H.pylori全菌免疫血清)為第一抗體(1∶50),羊抗鼠抗體為第二抗體(1∶2000),進(jìn)行Western blot鑒定,結(jié)果顯示：純化蛋白在約71 500處產(chǎn)生特異雜交帶,見圖2。證實(shí)了純化HpaA蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。

2.4 病理組織學(xué)檢查結(jié)果H.pylori攻擊感染實(shí)驗(yàn)小鼠2 w后,病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),在顯微鏡下,HE染色,對(duì)照組小鼠胃黏膜明顯萎縮,黏膜上皮組織充血、水腫、連續(xù)性被破壞,黏膜上皮組織固有層及黏膜下層均有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);Warthin-Starry硝酸銀染色,對(duì)照組小鼠胃黏膜均有H.pylori定植,H.pylori菌體膨脹,著棕黑色,較容易發(fā)現(xiàn)。獲得免疫保護(hù)小鼠胃黏膜的病理切片未見到炎癥反應(yīng)或炎癥不明顯和H.pylori定植,見圖3。

圖2 HpaA與小鼠抗HpaA免疫血清、H.pylori全菌抗原免疫小鼠血清的Western blot反應(yīng)1：純化HpaA蛋白與正常小鼠血清;2：純化 HpaA蛋白與HpaA免疫小鼠血清;3：純化HpaA蛋白與 H.pylori全菌抗原免疫小鼠血清Fig.2 Western blot reaction of HpaA with sera of HpaA immunized mice and H.pylori whole-cell antigens immunized mice1：HpaA and sera of normal mice;2：HpaA and sera of HpaA immunized mice;3：HpaA and sera of H.pylori whole-cell antigens immunized mice.

圖3 H.pylori攻擊感染實(shí)驗(yàn)小鼠胃組織切片3.1：純化 HpaA免疫小鼠胃黏膜切片HE染色(×200);3.2：PBS對(duì)照組小鼠胃黏膜切片HE染色(×200),黏膜上皮組織固有層及黏膜下層均有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);3.3：純化 HpaA免疫小鼠胃黏膜切片Warthin-Starry染色(×400);3.4：PBS對(duì)照組小鼠胃黏膜有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),胃粘膜胃小凹、黏膜上皮組織均可見 H.pylori定植(Warthin-Starry染色,×200)。Fig.3 Gastric histology in the mice post-challenge with H.pylori3.1：Gastric mucosa of mouse immunized with HpaA protein(HE stain,200);3.2：Gastric mucosa of PBS control mice after H.pylori infection,showing mild inflammation mainly in the deep mucosa and submucosal layer(HE stain,200);3.3：Gastric tissue of a mouse in HpaA+mLT63 immunized group(Warthin-Starry stain,400);3.4：One of the infected mice vaccinated with PBS showing mild inflammatory infiltration and H.pylori colonized within gastric crypts or on the epithelial surface(Warthin-Starry stain,400).

2.5 實(shí)驗(yàn)小鼠免疫保護(hù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)免疫、攻擊后,采用H.pylori培養(yǎng)、尿素酶試驗(yàn)、涂片Giemsa染色鏡檢、組織病理學(xué)鑒定4種方法檢測(cè)小鼠胃組織內(nèi)H.pylori定植情況。H.pylori定植陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：4種檢測(cè)方法中,有兩種或兩種以上陽(yáng)性者即可判定為陽(yáng)性感染,并以此來(lái)計(jì)算保護(hù)率〔6〕。Fisher＇s精確概率法分析顯示：各組之間保護(hù)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),HpaA+mLT63抗原加佐劑組與mLT63佐劑組、PBS對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),HpaA+mLT63抗原加佐劑組免疫保護(hù)率高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,而與 UreB+mLT63實(shí)驗(yàn)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組小鼠H.pylori的定植檢測(cè)Table 1 Colonization of H.pylori in the mice of different groups

3 討 論

H.pylori通常是胃黏膜組織的局部感染,其抗感染能力取決于粘膜免疫力,這決定了口服H.pylori疫苗是最有效的免疫途徑。雖然單獨(dú)口服保護(hù)性抗原也具有一定的免疫原性和免疫效應(yīng),但實(shí)驗(yàn)已證明輔以佐劑能增強(qiáng)免疫效果〔7〕。較理想的黏膜佐劑應(yīng)該高效、安全,能激活黏膜免疫系統(tǒng),在其存在的情況下抗原經(jīng)黏膜供給可引發(fā)抗原特異性全身和黏膜的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,同時(shí)能避免誘導(dǎo)黏膜耐受。目前,CT和LT兩種腸毒素被認(rèn)為是最有效的黏膜佐劑,但是它們的毒性限制了在人體的使用。利用基因工程構(gòu)建的LT無(wú)毒衍生物突變體能夠彌補(bǔ)這樣的不足,LT第63位氨基酸突變,使絲氨酸改變?yōu)橘嚢彼?使得 LTA失去NAD蛋白結(jié)合位點(diǎn),經(jīng)研究證實(shí)為無(wú)毒且具有較強(qiáng)的免疫原性和佐劑性。本研究免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí),選用了在大腸桿菌中表達(dá)和純化出大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mLT63融合蛋白作為免疫佐劑〔8〕。

國(guó)內(nèi)外的一些研究表明,H.pylori黏附素中的一些蛋白成分具有良好的抗原活性,可誘導(dǎo)出很強(qiáng)的菌株特異性免疫反應(yīng),其中H.pylori黏附素A(H.pyloriadhesion A,HpaA)由hpaA基因編碼,為細(xì)菌鞭毛鞘膜蛋白,幾乎存在于所有臨床分離H.pylori菌株的表面,是該菌的主要黏附因子,且氨基酸序列高度保守,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明hpaA是H.pylori定植的必要因子〔9〕,基本符合理想保護(hù)性抗原的要求。用純化的HpaA蛋白經(jīng)背部皮下和腹腔注射免疫實(shí)驗(yàn)小鼠,ELISA、Westen blot方法檢測(cè)和評(píng)價(jià)免疫小鼠血清中相應(yīng)抗體,表明純化蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。采用純化后的HpaA蛋白聯(lián)合黏膜免疫佐劑mLT63灌胃免疫小鼠,H.py lori攻擊感染后,評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原免疫實(shí)驗(yàn)組之間保護(hù)率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示HpaA和傳統(tǒng)的UreB抗原免疫保護(hù)效果相當(dāng),均高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HpaA蛋白能夠顯著減少H.pylori在小鼠胃內(nèi)的定植,產(chǎn)生了一定的免疫保護(hù)性,為研究幽門螺桿菌疫苗篩選免疫保護(hù)性蛋白提供了有意義的依據(jù)。

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