黃明翔,王 琳,張麗水,戴臘梅,張俊仙

2.解放軍第三 O九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所,北京100091

目前國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的致病性、非致病性非結(jié)核分枝桿菌(Non-tuberculosisMycobacterium,NTM)種類多,某些NTM對(duì)AIDS患者可能引起比正常人更嚴(yán)重、更廣泛的播散病理表現(xiàn)〔1-2〕。因此,準(zhǔn)確地鑒定分枝桿菌(Mycobacterium)菌種對(duì)于結(jié)核病或NTM病的診斷、治療和控制具有重要意義。

本研究以以傳統(tǒng)的菌種鑒定方法為對(duì)照,應(yīng)用DNA芯片對(duì)134株分枝桿菌分離株進(jìn)行菌種鑒定,以期為臨床提供快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、有效的菌種鑒定方法,為分枝桿菌病的診療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 源自本院2005年5月至2006年12月門

診及住院肺結(jié)核患者。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)按WS 196-2001結(jié)核病分類〔3〕。

1.2 標(biāo)本前處理 在痰瓶中加入6%的NaOH 20mL,充分混勻后,倒入專用離心管中,置震蕩器上震蕩15min,待痰液完全消化后,加入25mL生理鹽水緩沖后置于4 000r/min離心機(jī)中離心20min。

1.3 分枝桿菌培養(yǎng) 美國(guó)BD公司BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)儀培養(yǎng),有菌落生長(zhǎng)并經(jīng)抗酸染色為分枝桿菌者進(jìn)一步做藥物敏感性試驗(yàn)和菌種鑒定。

1.4 分枝桿菌傳統(tǒng)菌種鑒定 從BACTEC MGIT 960全自動(dòng)檢測(cè)儀中挑取分枝桿菌菌落分別做對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)、耐熱觸酶試驗(yàn)〔4〕。

1.5 DNA提取 采用解放軍第三O九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所制備的標(biāo)本前處理試劑盒提取 DNA,置-20℃保存?zhèn)溆谩?〕。

1.6 PCR-DNA膜芯片鑒定分枝桿菌菌種 采用解放軍第三O九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所制備的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒檢測(cè)上述臨床分離株,制備的基因芯片點(diǎn)陣見(jiàn)表1,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作〔5〕。若某探針的雜交信號(hào)強(qiáng)于其它探針,為該探針雜交陽(yáng)性,并可判定該菌株為此特異探針相對(duì)應(yīng)的菌種。

2 結(jié) 果

2.1 DNA芯片鑒定結(jié)果 通過(guò)傳統(tǒng)的分枝桿菌鑒定和DNA芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)、鑒定了134株分枝桿菌分離株,兩種方法鑒定結(jié)果一致和基本一致共112株,吻合率為83.6%(112/134),結(jié)果見(jiàn)表2,圖1。

表1 分枝桿菌菌種鑒定膜芯片的點(diǎn)陣Tab.1 DNA Chip of Mycobacterum

表2 通過(guò)傳統(tǒng)的菌種鑒定和DNA膜芯片檢測(cè)134株分枝桿菌臨床分離株的結(jié)果Tab.1 Identified of 134 Mycobacterum by traditional Identification and DNA Chip

圖1 應(yīng)用DNA膜芯片檢測(cè)分枝桿菌臨床分離株的代表性結(jié)果Fig.1 Identification of chinical mycobacterium with DNA chip

3 討 論

據(jù)目前所知,自然界中有致病性和非致病分枝桿菌(Mycobacterium,M.)200多種,其中除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、麻風(fēng)分枝桿菌等外,其余統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌(Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)〔6〕。全國(guó)一項(xiàng)調(diào)查表明〔2〕,在 441 例痰培養(yǎng)分枝桿菌陽(yáng)性病例中,經(jīng)過(guò)菌種鑒定,含牛結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為88.9%,其中真正屬于結(jié)核分枝桿菌者只有86.4%,而11.1%為非結(jié)核分枝桿菌。福建非結(jié)核分枝桿菌的比例則更高(13.3%)〔7〕。NTM 肺病在臨床癥狀、肺部 X線影像常與肺結(jié)核相似,同樣也可以在痰涂片抗酸染色檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性。但其中絕大多數(shù)對(duì)抗結(jié)核藥物并不敏感,往往導(dǎo)致治療失敗。因此,對(duì)分枝桿菌的快速菌種鑒定對(duì)結(jié)核病診療具有極為重要的意義。傳統(tǒng)的分枝桿菌鑒定方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)事,且準(zhǔn)確率和可重復(fù)性差。

1996年美國(guó)Affymetrix公司成功地首次應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的生物芯片以來(lái),世界各國(guó)在這方面的研究已獲得快速進(jìn)展且有新的突破。我國(guó)在應(yīng)用DNA芯片于分枝桿菌檢測(cè)和菌種鑒定方面都有新的突破,本研究結(jié)果證明用DNA芯片檢測(cè)技術(shù),可以簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異地將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種,為臨床提供正確的診療依據(jù)?！?-9〕

本研究以BACTEC MGIT 960培養(yǎng)鑒定法作對(duì)照,采用解放軍第三O九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所制備的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(基因芯片技術(shù))對(duì)臨床分離的134株分枝桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行了菌種鑒定,兩種方法鑒定結(jié)果一致和基本一致共112株,吻合率為83.6%(112/134),能夠快速的進(jìn)行菌種鑒定。但由于還存在芯片中標(biāo)準(zhǔn)菌株的數(shù)量和種特異DNA標(biāo)志物等原因,培養(yǎng)法鑒定為戈登分枝桿菌5株、胞內(nèi)分枝桿菌3株、龜分枝桿菌2株、蟾分枝桿菌、恥垢分枝桿菌和淺黃分枝桿菌各1株等菌種,芯片法未能作出明確的鑒定。因此,該芯片技術(shù)還有待于進(jìn)一步完善。

(感謝吳雪瓊教授的指導(dǎo))

〔1〕中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.1990年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料匯編〔C〕,1992,3：60-65.

〔2〕全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)小組.2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告〔J〕.中國(guó)防癆雜志,2002,24(2)：102.

〔3〕中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)〔M〕,WS 196-2001結(jié)核病分類,2001-07-20.

〔4〕張麗水,黃明翔,戴臘梅.應(yīng)用 BACT ECTMMGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)特殊標(biāo)本的檢測(cè)〔J〕.中國(guó)人獸共患病雜志,2004,20(12)：1238-1239.

〔5〕梁建琴,吳雪瓊,張俊仙,等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-膜芯片技術(shù)快速鑒定分枝桿菌菌種〔J〕.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(5)：289-292.

〔6〕汪小平,張?zhí)烀?新發(fā)現(xiàn)的非結(jié)核分枝桿菌研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)防癆雜志,1999,21(3)：175-176.

〔7〕劉坦業(yè),江秀文,俞文誠(chéng).福建省非結(jié)核分枝桿菌感染流行情況〔J〕.中國(guó)人獸共患病雜志,1995,11(1)：53-55.

〔8〕劉金偉,匡鐵吉,王金河,等.分枝桿菌鑒定方法的比較研究〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2000,23(10)：631.

〔9〕張俊仙,吳雪瓊,邢婉麗,等.應(yīng)用 DNA 微陣列技術(shù)快速鑒定分枝桿菌菌種〔J〕.中國(guó)防癆雜志,2007,29(1)：1-7.