呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是單股負(fù)鏈RNA病毒,屬副黏病毒科,肺炎病毒屬,是世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體〔1〕。自然感染率高,還可引起急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征。目前RSV感染的病理機(jī)制尚不明確,迄今無(wú)有效的治療藥物和理想的疫苗接種,抗病毒與抗炎癥的聯(lián)合治療可能是臨床治療RSV感染有效的方案〔2〕。Toll樣受體3(T oll-like receptor 3,TLR3)能特異性地識(shí)別病毒雙股RNA而活化細(xì)胞,RSV在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可產(chǎn)生大量雙股RNA(double stranded RNA,dsRNA),因此能被TLR3識(shí)別而活化〔3〕。病毒感染時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的最重要抗炎細(xì)胞因子是干擾素(interferon,IFN),其重要性不但表現(xiàn)為抗病毒作用,還包括多種免疫調(diào)節(jié)作用,影響機(jī)體的天然免疫與獲得性免疫。巨噬細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮抗病毒作用的重要免疫細(xì)胞,可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子,參與免疫調(diào)節(jié)。RSV融合蛋白(F蛋白)的抗原性比較穩(wěn)定,很少變異,細(xì)胞免疫在對(duì)抗RSV感染中起主要作用,通過(guò)檢測(cè)F蛋白含量,可反映 RSV的增殖狀況〔4〕。本文探討RSV 感染巨噬細(xì)胞時(shí) TLR3活化介導(dǎo)的IFN產(chǎn)生機(jī)制及其抗病毒作用,為臨床RSV感染的預(yù)防與治療提供新的思路,目前在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 呼吸道合胞病毒為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Long株,Hep-2細(xì)胞為人喉癌上皮細(xì)胞,均為安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存;RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)研究所魏海明教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 DM EM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品),新生牛血清(杭州四季清公司產(chǎn)品),T rizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó) Fermentas公司產(chǎn)品),抗鼠T LR3抗體(美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品),其他試劑為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染量測(cè)定 將凍存的病毒株復(fù)蘇后經(jīng)Hep-2細(xì)胞增殖,按 Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 將RAW264.7細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿時(shí)換細(xì)胞維持液,接種0.1mL病毒,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為：感染組(RSV組);(TLR3抑制組(T LR3-+RSV組)：參照文獻(xiàn)〔5〕,并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,預(yù)先孵育于含濃度200 μ g/mL TLR3抗體的維持液中8 h后,以抑制T LR3受體,再行 RSV感染;(正常對(duì)照組。

每組設(shè)立4 h、8 h、12 h、16 h和24 h不同的感染時(shí)間點(diǎn),每組重復(fù)4個(gè)復(fù)孔。以同等條件下培養(yǎng)的未感染病毒細(xì)胞為正常對(duì)照。

1.2.3 TLR3,IFN-α,IFN-β,RSV F的mRNA 水平檢測(cè)以半定量 RT-PCR方法,檢測(cè)各組 T LR3,IFN-α,IFN-β,RSV F的mRNA表達(dá)水平。小鼠各基因的引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1,各基因的PCR反應(yīng)條件和循環(huán)次數(shù)見(jiàn)表2,以小鼠β-actin的 mRNA表達(dá)作為內(nèi)參。用20g/L瓊脂糖凝膠DNA電泳檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。凝膠成像分析儀掃描拍照,Labworks軟件分析測(cè)定條帶灰度值,用目的基因條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值,作為目的基因相對(duì)表達(dá)量,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 小鼠各基因的引物序列和擴(kuò)增片段大小Tab.1 The primer sequence and length for extended product of each mouse gene

表2 各基因PCR反應(yīng)條件和循環(huán)次數(shù)Tab.2 The reaction conditions and cycle No.for polymerase chain reaction of each gene

2 結(jié) 果

2.1 病毒半數(shù)感染量滴定 病毒TCID50滴定結(jié)果為10-6.2/0.1mL。

2.2 T LR3 mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)：半定量RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示,RAW264.7正常細(xì)胞T LR3表達(dá)基線很低,在 RSV組 TLR3 mRNA的表達(dá)上調(diào)且有時(shí)間依賴性。與正常對(duì)照組相比,RSV感染組 TLR3 mRNA的表達(dá)量逐漸增加,在感染4 h后T LR3 mRNA升高,升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,8 h顯著升高,24 h達(dá)最高峰,是基礎(chǔ)表達(dá)量的6倍多,升高均有有顯著性差異,在T LR3-+RSV組,TLR3 mRNA的表達(dá)雖也上調(diào),但較RSV感染組明顯降低,都有顯著性差異,見(jiàn)圖1。

圖1 RSV感染不同時(shí)間對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR3 mRNA表達(dá)的影響1：對(duì)照,2～ 6：分別為 4h,8h,12h,16h,24h.*：P＜0.05,**：P＜0.01 vs normal group;#：P＜0.05,##：P＜0.01 vs RSV group(n=4)Fig.1 The result of TLR3 mRNA expression in RAW264.7 macrophages infected with RSV by semiquantitative RT-PCR assay1 ：control,2 ：4h,3：8h,4 ：12h,5 ：16h,6：24h.

圖2 RSV感染不同時(shí)間對(duì)RAW264.7細(xì)胞 IFN-αmRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果1：對(duì)照,2～6：分別為 4h,8h,12h,16h,24h.*：P＜0.05,**：P＜0.01vs normal group;#：P＜0.05 vs RSV group(n=4)Fig.2 The result of IFN-αmRNA expression in RAW264.7 macrophages infected with RSV at various time points by RT-PCR1：control,2 ：4h,3 ：8h,4：12h,5：16h,6：24h.

2.3 IFN-αmRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)：RTPCR測(cè)定結(jié)果顯示,正常組中IFN-αmRNA表達(dá)基線很低,在RSV組IFN-αmRNA的表達(dá)上調(diào)且有時(shí)間依賴性。與正常對(duì)照組相比,RSV組IFN-α mRNA的表達(dá)逐漸增加,在感染4 h后IFN-αmRNA升高,12 h后升高有顯著性差異,24 h達(dá)最高峰,是基礎(chǔ)表達(dá)量的4倍。在 TLR3-+RSV組,IFN-αmRNA的表達(dá)雖也上調(diào),但較RSV感染組低,在感染16 h后IFN-αmRNA的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖 2(IFN α/β-actin為各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)應(yīng)比值)。

2.4 IFN-β mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示,RAW264.7正常細(xì)胞組IFN-β mRNA的表達(dá)基線很低,在RSV組IFN-β mRNA的表達(dá)上調(diào)且有時(shí)間依賴性。與正常對(duì)照組相比,RSV組IFN-β mRNA的表達(dá)逐漸增加,在感染4 h后IFN-β mRNA升高,12 h顯著升高,24 h達(dá)最高峰,是基礎(chǔ)表達(dá)量的4倍多,升高有顯著性差異。在TLR3-+RSV組,IFN-β mRNA的表達(dá)也上調(diào),但較感染組低,在感染 12 h后 IFN-β mRNA的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,24 h后降低有顯著性差異,僅為RSV感染組表達(dá)量的一半,見(jiàn)圖3(IFNβ/β-actin為各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)應(yīng)比值)。

2.5 RSV F基因mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示,正常細(xì)胞無(wú)RSV F基因表達(dá);RSV組F基因的mRNA表達(dá)上調(diào)且有時(shí)間依賴性,F基因的mRNA表達(dá)量逐漸增加;在TLR3-+RSV組,抑制T LR3的活化后,RSV F基因的mRNA表達(dá)明顯升高,與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的 RSV感染組相比,12 h后升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,24 h升高有顯著性差異,見(jiàn)圖4。

圖3 RSV感染不同時(shí)間對(duì)RAW264.7細(xì)胞IFN-β mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果1.對(duì)照,2～6：分別為 4h,8h,12h,16h,24h.* ：P＜0.05,**：P＜0.01vs normal group;#：P＜0.05,##：P＜0.01 vs RSV group(n=4)Fig.3 The result of IFN-β mRNA expression in RAW264.7 macrophages infected with RSV at various time point by RT-PCR1 ：control,2 ：4h,3：8h,4 ：12h,5 ：16h,6 ：24h.

圖4 RSV感染RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)RSV F基因mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果1.對(duì)照,2～6：分別為 4h,8h,12h,16h,24h.*：P＜0.05,**：P＜0.01vs normal group(n=4)Fig.4 The result of RSV F gene mRNA expression in RAW264.7 macrophages infected with RSV at various time point by RT-PCR1：control,2 ：4h,3：8h,4 ：12h,5：16h,6：24h.

3 討 論

呼吸道合胞病毒是嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒性病原體,病毒感染后可誘導(dǎo)宿主表達(dá)和產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧等生物活性遞質(zhì)〔6〕,使氣道呈現(xiàn)高反應(yīng)性,導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)支氣管炎、肺炎、哮喘等疾病。天然免疫系統(tǒng)的細(xì)胞可表達(dá)模式識(shí)別受體(patternrecognition receptors,PRR),Toll樣受體即是一類PRR,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在抗病原微生物免疫防御反應(yīng)中起重要作用的受體蛋白,能識(shí)別和啟動(dòng)不同病原體的相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),介導(dǎo)先天性免疫和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答來(lái)抵御病毒的感染〔7〕。IFNα/β屬Ⅰ型干擾素,是發(fā)揮早期抗病毒和免疫刺激活性的主要效應(yīng)分子。RSV F蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的為 TLR所識(shí)別的病毒性PAMP〔8〕,T LR3 是識(shí)別病毒 dsRNA 的受體 ,在抗病毒,阻止病毒復(fù)制,保護(hù)機(jī)體中起重要作用〔9〕。Levy等[〔10〕研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體對(duì)病毒感染的固有免疫應(yīng)答至少有兩條途徑,第一條途徑主要是病毒通過(guò)膜融合或胞吞等形式進(jìn)入細(xì)胞,病毒核衣殼釋放到被感染細(xì)胞的胞漿中,病毒在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生dsRNA,最終激活NF-κ B和干擾素調(diào)節(jié)因子 3(IRF3),產(chǎn)生干擾素。第二個(gè)途徑是被感染細(xì)胞釋放出病毒dsRNA,與 TLR3結(jié)合激活NF-κ B 和IRF3,產(chǎn)生干擾素。RSV F蛋白為跨膜糖蛋白,參與病毒外膜與宿主細(xì)胞膜的融合及細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中合胞體的形成,還具有促使RSV在感染細(xì)胞間傳播及溶血的作用〔11〕。RSV在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可產(chǎn)生大量的dsRNA,并且我們的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)TLR3能識(shí)別RSV而被活化〔12〕。 Thompson 等〔13〕報(bào)道 T LR3能直接賦予機(jī)體天然抗病毒感染能力,MacDonald等〔14〕也報(bào)道TLR3能夠誘導(dǎo)針對(duì)單純性皰疹病毒的固有免疫應(yīng)答。Hultcrantz等〔15〕證實(shí)了人類胰島細(xì)胞通過(guò)T LR3識(shí)別柯薩奇病毒產(chǎn)生I型IFN,而在IFN的刺激之下,胰島細(xì)胞可以產(chǎn)生大量抗病毒蛋白而進(jìn)入抗病毒階段,從而阻止病毒復(fù)制,保護(hù)機(jī)體。Hardarson〔16〕報(bào)道的 EMCV 感染的 TLR3基因敲除小鼠顯示高的死亡率,間接表明T LR3可限制病毒的復(fù)制,從而延緩疾病惡化進(jìn)程。另有報(bào)道T LR3在病毒感染中不但發(fā)揮保護(hù)作用,甚至有治療作用,如TLR3激動(dòng)劑對(duì)生殖道皰疹病毒感染有保護(hù)作用〔17〕。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平顯示,RSV感染RAW264.7細(xì)胞后,可顯著上調(diào)TLR3和I型干擾素的表達(dá),病毒F蛋白基因的表達(dá)增加,且上調(diào)作用和感染之間存在時(shí)間依賴性關(guān)系。在給予TLR3抗體以阻斷TLR3活化后,I型干擾素的顯著下降及RSV F蛋白基因的上調(diào),說(shuō)明TLR3的活化在一定程度上可抑制感染中的 RSV復(fù)制,其誘生IFN的抗病毒感染保護(hù)作用,與Hidaka報(bào)道的在流感病毒感染者中觀察到的 T LR3作用一致〔18〕,但與Rudd等〔19〕用等量 RSV感染 TLR3轉(zhuǎn)染的人胚腎293細(xì)胞時(shí) TLR3在RSV復(fù)制中沒(méi)有作用的結(jié)果不符,考慮是其所用細(xì)胞類型不同,因肺的巨噬細(xì)胞是RSV引起炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞及免疫細(xì)胞,我們選用的 RAW264.7為巨噬細(xì)胞,而 HEK293細(xì)胞則為人胚腎上皮細(xì)胞。此外,實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),在封閉T LR3后 IFN-β較IFN-α顯著下降,表明了IFN-β可能是由TLR3誘導(dǎo)產(chǎn)生的最主要I型干擾素,I型干擾素的表達(dá)至少是部分依賴TLR3活化,這與Matsumoto等報(bào)道的IFN-β是由TLR3誘導(dǎo)產(chǎn)生的最主要細(xì)胞因子的結(jié)果一致。

本研究表明,在RSV感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后,被活化的T LR3具有誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN的抗病毒感染保護(hù)作用,尤其是以IFN-β產(chǎn)生為主。T LR3作為其關(guān)鍵因素,進(jìn)一步研究其在機(jī)體抗病毒感染中的作用,可為臨床治療RSV感染及研發(fā)抗RSV新藥提供重要思路與理論基礎(chǔ)。但實(shí)驗(yàn)中我們尚未能進(jìn)行空斑形成試驗(yàn)來(lái)測(cè)定RSV病毒滴度,以判斷其增殖水平,這將在以后的研究中加進(jìn)一步證實(shí)。另外,以往人們普遍認(rèn)為抗體發(fā)揮其生物學(xué)活性的區(qū)域僅限于細(xì)胞外介質(zhì),而細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)是抗體的禁區(qū),直至1977年Gilliam等首次發(fā)現(xiàn),抗ENA抗體可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入上皮細(xì)胞內(nèi),并定位于上皮細(xì)胞核,從而證明抗體能穿透活細(xì)胞膜。近年來(lái)又有實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗體穿透活細(xì)胞的現(xiàn)象存在,對(duì)于TLR3抗體進(jìn)入活細(xì)胞的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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