2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室,蘭州 730046

朊蛋白(Prion protein,PrP)是由宿主常染色體上單拷貝基因的單個外顯子編碼的一種高度保守的細胞膜糖蛋白。“唯蛋白”假說(protein only)認為傳染性海綿狀腦病(TSE)的致病因子是由動物體PrP基因編碼的細胞型朊蛋白(PrPC)憑借其部分α螺旋重新折疊成β-片層而轉(zhuǎn)變成致病型的PrPSc組成的〔1〕。但至今關(guān)于PrP三級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換機理和構(gòu)象病的產(chǎn)生機制仍不清楚。雞是最早發(fā)現(xiàn)的含有PrP基因的鳥類〔2〕,然而關(guān)于雞(Ch)PrP序列及結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究很少。因此,本研究通過對羅曼雞PrP基因克隆測序,對所得的ChPrP基因序列和其它物種PrP基因比對分析,獲得基于PrP基因的物種遺傳信息,進而推導(dǎo)朊蛋白病種間屏障的形成機制。并參考已有的關(guān)于ChPrP高級結(jié)構(gòu)的核磁共振(NMR)數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)軟件對ChPrP基因推導(dǎo)的氨基酸序列深入分析,獲得ChPrP結(jié)構(gòu)特征,推測可能參與構(gòu)象轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)區(qū)域。進一步通過和哺乳動物(人)PrP高級結(jié)構(gòu)相比較,分析其差異性,推測鳥類不感染朊蛋白病的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血樣 無菌采取8只健康羅曼雞的新鮮血液,以抗凝劑抗凝。

1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒(Genome DNA Extraction Kit),EX Taq DNA聚合酶,DNA凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0),pMD18-T Vector。

1.3 引物的設(shè)計和合成 利用Primer Premier 5.0軟件,根據(jù)已報道的雞PrP基因cDNA及基因組序列,針對該基因開放閱讀框(ORF)上游、下游保守序列設(shè)計兩對特異引物。引物由Invitrogen公司合成。上游引物 F2 5′-CAAAAGCGAGGACAAGGAAC-3′下游引物 R2 5′-GCTGGGGTCAAGGCTACAAC-3′上游引物 F1 5′-GATGCT TGATTTCGGTGGAA-3′下游引物 R1 5′-CGTGCTTGAAGTTGGTTTTGT-3′

1.4 總DNA的提取 全血DNA提取按TIANGEN公司基因組提取試劑盒方法進行。

1.5 朊蛋白基因的PCR擴增 反應(yīng)體系50μ L,其中總 DNA 4.0μ L 、EX TaqDNA 聚合酶 25μ L 、引物(10 pmol/L)各 2.4 μ L、加滅菌蒸餾水至 50μ L。反應(yīng)條件,第一步,94℃5 min;第二步,94℃45 s,58℃/56℃45 s,72℃45 s,共進行35個循環(huán);第三步,72℃8 min。

1.6 目的基因克隆 PCR產(chǎn)物的電泳檢測和回收PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,參照標準DNA Marker進行擴增DNA片段大小判定,如與預(yù)計目的DNA片段大小一致,則以DNA凝膠回收試劑盒回收目的 DNA片段。按 TaKaRa公司的pMD18-T Vector和E.coliDH5αCompetent Cell使用說明進行目的DNA片段的連接和轉(zhuǎn)化,劃線接種在含有氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)后,挑選白色菌落并接種在 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.7 重組質(zhì)粒的測序 由大連寶生物工程有限公司完成。

1.8 序列及結(jié)構(gòu)分析利用各種生物信息學(xué)軟件進行序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1 PrP基因的PCR擴增 以8只羅曼雞全血DNA為模板,設(shè)計兩對特異性引物進行PCR擴增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得兩組分別約482bp和621bp的預(yù)期片段見圖1。

圖1 ChPrP基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳1-8：PCR 產(chǎn)物 ;M ：DNA marker DL2000Fig.1 Electrophoresis of PCR-amplified products1-8：PCR products;M ：DNA marker DL2000

2.2 PrP基因測序結(jié)果及分析 通過對兩組測序結(jié)果拼接獲得1015 bp的片段,包含了ChPrP基因的完整編碼區(qū)及部分內(nèi)含子序列。序列分析表明8只羅曼雞PrP基因ORF有兩處發(fā)生堿基置換(243C→T,296A→G),其中243位點為同義碼替換。通過在線 BLAST(NW_001471575)發(fā)現(xiàn)ChPrP基因位于雞的第22號染色體。

2.3 雞朊蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.1 一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 應(yīng)用ProtParam、TMpred、TMHMM等工具分析ChPrP基因推導(dǎo)氨基酸序列表明,ChPrP多肽由273個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為29 948.7,理論 PI值為 9.05,正電荷占較高組分,總平均親水性為-0.573。8只羅曼雞PrP多肽N-端均有7個富含Pro的六肽重復(fù)PHNPGY/PQNPGY,并在99位點發(fā)現(xiàn)Q→R突變見圖2。

2.3.2 雞朊蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)特征 應(yīng)用PredictProtein工具分析顯示：ChPrP二級結(jié)構(gòu)由34.1%的螺旋,8.8%的折疊及57.1%的無規(guī)卷曲組成。N-端約100個殘基形成無規(guī)則區(qū)域,C-端形成保守的球狀結(jié)構(gòu)域。N-糖基化位點位于194,209和218位點。191,238位點的氨基酸殘基可形成二硫鍵穩(wěn)定構(gòu)象。位于99位點的Q→R突變對ChPrP二級結(jié)構(gòu)無明顯影響見圖3。

應(yīng)用SWISS-MODEL/SWISS-PdbView等工具,按照同源建模法構(gòu)建出ChPrP和人(Hu)PrP C-端約 100個殘基的區(qū)域(圖 4),如圖顯示ChPrPC-端是由3個α-螺旋(157-167,185-200,219-246)和2個短的反向平行β-折疊(142-144,174-176)組成的球狀結(jié)構(gòu)域;HuPrP C-端亦由3個α-螺旋(144-152,173-189,195-223)和2個短的反向平行β-折疊(129-131,161-163)組成,且二者二級結(jié)構(gòu)組成元件相似。

圖4 ChPrP和HuPrP三級結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.4 The simulated three-dimensional structures of ChPrP and HuPrP

3 討 論

3.1 PrP基因進化關(guān)系與朊蛋白病種間屏障的形成PrP基因作為一個古老而保守的基因廣泛存在于各種生物體中。構(gòu)建基于PrP基因的系統(tǒng)進化樹見圖5,分析顯示ChPrP基因同其他禽類PrP基因進化關(guān)系較近,與兩棲、爬行類位于同一進化分支,同源程度較高,而與哺乳動物處于不同的進化分支,進化關(guān)系較遠,基于PrP基因的進化關(guān)系與物種親緣關(guān)系相符。研究發(fā)現(xiàn),朊蛋白病發(fā)生的一個重要表現(xiàn)是具有種間屏障現(xiàn)象,應(yīng)用嵌合朊蛋白轉(zhuǎn)基因老鼠實驗證實,受體和供體物種同源程度高低決定著朊蛋白病的種間屏障〔3〕。但是朊蛋白病作為一種構(gòu)象疾病,單純的氨基酸序列同源程度高低并不能完全決定其種間屏障的產(chǎn)生,例如：人PrP基因同牛、羊PrP基因同源程度相近,已發(fā)現(xiàn)多例因食用患病牛而感染TSE的病例,而羊瘙癢病存在已久,卻未發(fā)現(xiàn)一例因食用病羊而感染 TSE的病例。通過NM R分析發(fā)現(xiàn),人PrP高級結(jié)構(gòu)與朊蛋白病抗性羊(ARR)PrP構(gòu)象相似〔4〕,據(jù)此認為 PrP構(gòu)象同源性高低在一定程度上決定著該病種間屏障的產(chǎn)生。而PrP構(gòu)象主要是由C-端保守的球狀結(jié)構(gòu)域決定的,位于球狀結(jié)構(gòu)域末端的高變區(qū)可能是“蛋白X”的特異性結(jié)合表位,“蛋白X”作為分子伴侶介導(dǎo)PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)?PrPSc,進而影響 PrP種間屏障的形成〔5〕。另外,PrP表面電荷分布的不同,可作為重要的構(gòu)象特征影響種間屏障的產(chǎn)生〔6〕?？傊?朊蛋白病種間屏障的產(chǎn)生不僅僅是由物種同源程度或PrP基因序列同源性高低來決定,其構(gòu)象同源程度和穩(wěn)定性,以及與構(gòu)象形成相關(guān)的一些輔助因子起關(guān)鍵作用。

圖5 68個物種的PrP基因推導(dǎo)氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree for PrP amimo acid sequence of 68 species of animal

3.2 ChPrP高級結(jié)構(gòu)特征以及與構(gòu)象轉(zhuǎn)變的關(guān)系朊蛋白病作為一種致死性的構(gòu)象疾病,確定其致病機理的關(guān)鍵在于了解PrP的構(gòu)象轉(zhuǎn)變機制。盡管已知的大多數(shù)脊椎動物都含有PrP基因,但是朊蛋白病僅見于哺乳動物,尚未發(fā)現(xiàn)非哺乳動物PrP出現(xiàn)致病型構(gòu)象。分析顯示,哺乳動物PrP基因間相似程度在90%以上,ChPrP基因同哺乳動物相比只有30%相同〔7〕,然而ChPrP N-端六肽重復(fù)元件PHNPGY和HuPrP N-端八肽重復(fù)元件PHGGGWGQ在氨基酸組成上十分相似,二者主要由非極性氨基酸組成,均含有一個芳香族氨基酸和一個極性氨基酸。分析ChPrP和HuPrP高級結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn),二者C-端分子構(gòu)象相似,均為由2個短的反向平行β-折疊和3個α-螺旋組成的結(jié)構(gòu)域,且組成的二級結(jié)構(gòu)元件長度及位置基本相同,ChPrP C-端192,237位點的半胱氨酸殘基能夠形成二硫鍵,連接α 2和α 3以穩(wěn)定其球狀結(jié)構(gòu)域構(gòu)象,與NMR結(jié)果相同〔8〕,而HuPrP模型C-端構(gòu)象與NMR結(jié)果不同〔9〕,其179,214位點的半胱氨酸殘基未形成二硫鍵,C-端結(jié)構(gòu)域較為松散。據(jù)此推想至今未發(fā)現(xiàn)ChPrP致病型結(jié)構(gòu)可能是由于ChPrP形成的構(gòu)象更加穩(wěn)定,不易發(fā)生變化。然而應(yīng)用MD分析Hu-PrP和ChPrP結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn),從整個分子來看,二者構(gòu)象熱穩(wěn)定性并無顯著差異〔10〕。顯然PrP自身的穩(wěn)定性并不能完全影響其構(gòu)象變化,“蛋白X”、DNA、RNA、金屬離子等輔助因子在PrP構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要作用〔11-12〕。通?！暗鞍譞”被認為是介導(dǎo)PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc的分子伴侶,它能夠結(jié)合PrP C-端高變區(qū)發(fā)揮作用〔13〕。而且與哺乳動物PrP構(gòu)象不同,ChPrP N-端串聯(lián)重復(fù)區(qū)形成穩(wěn)定的環(huán)狀構(gòu)象,結(jié)合銅離子的能力明顯弱于哺乳動物,甚至成熟的ChPrP不能結(jié)合銅離子,這一點有利于維持ChPrP構(gòu)象穩(wěn)定性〔14〕。除此之外,PrP構(gòu)象還受到多種環(huán)境因素調(diào)控,研究發(fā)現(xiàn)溫度、pH等的變化也會影響PrP構(gòu)象的形成〔15〕,據(jù)此認為,PrP構(gòu)象轉(zhuǎn)變是由多種因素共同作用產(chǎn)生的,不同的環(huán)境可能造就不同構(gòu)象的PrP,那么同一生物體內(nèi)是否可能含有不同構(gòu)象的PrP,有待進一步研究。

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