王 濤,劉麗云,王 娉,熊衍文,白雪梅,葉長(zhǎng)蕓,徐建國(guó)

2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206

腸出血性大腸埃希菌(EHEC)O157∶H7是引起人類(lèi)感染性腹瀉的病原菌,由于可導(dǎo)致患者出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(H US)、血栓性血小板減少性紫癜(T TP)等病死率高的疾病〔1〕,因而已成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。大腸埃希菌O157∶H7主要依靠它產(chǎn)生的志賀毒素、溶血素和對(duì)上皮細(xì)胞的粘附素引起人體的損害。其中志賀毒素(Shiga toxin,Stx)包括志賀毒素1和志賀毒素2,是引起人類(lèi)溶血性尿毒綜合征和血栓性血小板減少性紫癜的主要毒力因子,分別由st x1、stx2基因編碼。而由hlyA和eaeA基因編碼的溶血素和對(duì)上皮細(xì)胞的粘附素也是重要的致病因子。為了解我國(guó)部分省區(qū)大腸埃希菌O157∶H7的毒力基因攜帶特點(diǎn),采用PCR方法對(duì)1992-2006年我國(guó)部分省區(qū)分離到的大腸埃希菌O157∶H7菌株的特異基因及毒力基因進(jìn)行檢測(cè)分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)菌株分離自中國(guó)江蘇、安徽、河南、河北、山東、寧夏、天津、云南八個(gè)不同地區(qū)的病人,牛、羊等家畜家禽以及食品和飲用水,并經(jīng)本室系統(tǒng)生化鑒定,O157及H7血清復(fù)核后保存。陽(yáng)性對(duì)照菌株EDL933及陰性對(duì)照菌株MG1655均由本室保存。DNA提取試劑盒由北京天根公司提供。PCR主要試劑及Taq DNA聚合酶購(gòu)自T aKaRa公司。PCR儀為L(zhǎng)abcycler(SensoQuest)。凝膠成像系統(tǒng)為Gel Doc XR(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 制備DNA模板 按試劑盒方法提取實(shí)驗(yàn)菌株DNA模板,置-20℃保存。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔2-6〕,并略作修改,由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列及PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

1.2.3 PCR檢測(cè) 以O(shè)157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌株EDL933和MG1655菌株作為陽(yáng)性及陰性對(duì)照,按照常規(guī)PCR方法,分別用6對(duì)引物擴(kuò)增相應(yīng)DNA片段,取5μ L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化后,以6對(duì)引物用相同的條件對(duì)345株菌進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 資料統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,統(tǒng)計(jì)各毒力基因攜帶率,并用SPSS 11.5軟件對(duì)人及不同動(dòng)物之間毒力基因的攜帶率差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 引物特異性檢測(cè) 以EDL933為模板,加入相應(yīng)單一引物進(jìn)行擴(kuò)增,均可擴(kuò)增出相應(yīng)目標(biāo)條帶,而陰性對(duì)照MG1655及空白對(duì)照未見(jiàn)擴(kuò)增(圖1)。

2.2 O157∶H7菌株檢出情況 經(jīng)O157(rfbEO157)及H7(f liCH7)抗原特異基因檢測(cè)末明,我國(guó)1992-2006年收集的345株O157、H7抗原陽(yáng)性的菌株rf bEO157及f liCH7特異基因均為陽(yáng)性。

2.3 O157∶H7菌株的毒力基因檢測(cè) 對(duì)收集的O157∶H7菌株四種毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示,st x2基因的陽(yáng)性率為91.9%,但只有少數(shù)菌株(13.3%)攜帶st x1基因。攜帶有stx1基因的菌株同時(shí)也攜帶有st x2基因的占97.9%,且只分布在1992年(4株)、1999年(15株)、2001年(19株)、2002年(6株)及2005年(1株)分離的菌株中。eaeA和hly A基因的陽(yáng)性率分別為99.4%和99.1%。檢測(cè)菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2為主(見(jiàn)表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),stx2陽(yáng)性的317株菌中,eaeA均為陽(yáng)性,hly A基因陰性的菌株只有2株;而stx1或stx2陰性的27株菌中,eaeA均為陽(yáng)性,hlyA陽(yáng)性的為26株。

2.4 菌株來(lái)源及毒力基因分析 本研究中的345株菌中,來(lái)源于人的菌株25株中,stx1的陽(yáng)性率為32.0%,stx2陽(yáng)性率為92.0%。其余大多數(shù)來(lái)源于動(dòng)物宿主。來(lái)源于羊的菌株中92.6%攜帶st x2基因,僅有1.4%攜帶stx1基因,來(lái)源于牛、豬、雞的菌株st x2、stx1基因陽(yáng)性率分別為91.7%、10.0%,87.2%、6.4%,88.2%、8.8%(圖 2)。人及不同動(dòng)物之間st x2基因的攜帶率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.980,P=0.739)。

3 討 論

1999年我國(guó)江蘇省徐州市及鄰近的安徽省發(fā)生了一次大腸埃希菌O157∶H7感染暴發(fā),導(dǎo)致177人死亡。2000年在河南省又發(fā)生了一次暴發(fā),導(dǎo)致

28人死亡〔7〕。本次實(shí)驗(yàn)中的菌株主要分離自1999-2000年。近年來(lái)雖然沒(méi)有出現(xiàn)大的O157∶H7感染暴發(fā),但從中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2006-2008年的傳染病監(jiān)測(cè)報(bào)告看,每年均能從人或動(dòng)物中分離出產(chǎn)毒性大腸埃希菌O157∶H7菌株。我們對(duì)345株大腸埃希菌O157∶H7的特異基因檢測(cè)表明,O157及H7抗原陽(yáng)性的菌株rfbEO157及f liCH7特異基因均為陽(yáng)性。因此在實(shí)際篩查工作中,可以通過(guò)簡(jiǎn)單快速的基因檢測(cè),來(lái)取代繁瑣耗時(shí)的血清學(xué)試驗(yàn)。

表1 PCR引物序列、反應(yīng)條件及擴(kuò)增片段大小Table 1 The sequence of primers for the PCR,annealing temperature and the sizes amplified

表2 345株O157∶H7菌株來(lái)源及毒力基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 The virulent genes profiles of 345 O157∶H7 isolates

大腸埃希菌O157∶H7可攜帶不同型別的stx基因,stx基因的存在及具有活性的Stx是影響疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的重要因素,Stx2能引起更加嚴(yán)重的癥狀和組織病理學(xué)改變,與嚴(yán)重疾病的關(guān)系較Stx1更為密切〔7-8〕。對(duì)345株菌株的毒力基因檢測(cè)表明我國(guó)O157∶H7菌株主要為eaeA+hly A+stx2毒力基因型,而stx1單獨(dú)陽(yáng)性的菌株只有1株。從2006-2008年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的監(jiān)測(cè)報(bào)告看,近年分離的產(chǎn)毒性O(shè)157∶H7菌株也只有st x2基因陽(yáng)性,而沒(méi)有stx1陽(yáng)性的菌株。部分人和動(dòng)物來(lái)源的菌株只檢測(cè)到eaeA和hlyA毒力基因,而stx1或stx2基因均陰性,這類(lèi)菌株在致病性和流行病學(xué)方面的意義尚不清楚。

毒力基因的存在是病原菌導(dǎo)致機(jī)體感染的重要條件。對(duì)動(dòng)物來(lái)源的大腸埃希菌O157∶H7毒力基因分析表明,攜帶毒力基因的菌株廣泛存在于羊、牛等動(dòng)物宿主中。中國(guó)大腸埃希菌O157∶H7的感染多發(fā)在農(nóng)村,由于農(nóng)村地區(qū)羊、牛等家畜家禽常見(jiàn)且多為散養(yǎng),認(rèn)為羊、牛等家畜家禽是大腸埃希菌O157∶H7感染的重要傳染源,動(dòng)物宿主在大腸埃希菌O157∶H7感染的暴發(fā)流行中具有重要作用。因此,掌握動(dòng)物宿主的帶菌情況在預(yù)防和控制大腸埃希菌 O157∶H7感染流行的工作中具有重要意義。

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