梁曉雯，周 靜，黃 艷，于民權(quán)，程 旸，方泰惠，金 路，許 立

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，江蘇南京 210029)

環(huán)維黃楊星D(cyclovirobuxine D，CVB-D)系從黃楊科植物小葉黃楊(Buxus microphylla Sieb.et Zucc.var.sinica Rehd.et Wils.)及其同屬植物中提取的一種生物堿，為我國研制成功的治療心腦血管疾病的新藥，具有行氣活血和通絡(luò)止痛功能，主要用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、冠心病和心律失常。它對(duì)心血管系統(tǒng)具有強(qiáng)心，抗心絞痛和抗心律失常等作用［1－2］。對(duì)CVB-D的藥理及藥效報(bào)道較多，而對(duì)于其毒理學(xué)研究報(bào)道較少。

CVB-D較大劑量長期應(yīng)用，無論是口服或靜脈注射給藥，均可對(duì)肝臟、心臟、腎臟等器官產(chǎn)生毒性作用，嚴(yán)重的可引起死亡［1，3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ip給予CVB-D 8 mg·kg－13個(gè)月，有3只動(dòng)物給藥期間出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等毒性反應(yīng)，且BUN明顯升高;CVB-D 4和8 mg·kg－1組部分動(dòng)物出現(xiàn)腎臟的遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞變性、壞死及蛋白管型等病理改變［4］。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，大鼠連續(xù)ip給予CVB-D 2個(gè)月，觀察CVB-D致大鼠腎臟毒性的劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系，并探討其腎臟毒性的可逆性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、試劑與儀器

SD大鼠，清潔級(jí)，80～100 g，120只，雌雄各半;浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(浙)2003-001。實(shí)驗(yàn)前，大鼠給予適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。CVB-D:為白色粉末狀結(jié)晶，南京小營藥廠提供，純度≥96%，批號(hào):20050802。由于CVB-D難溶于PBS，故臨用前用PBS配成所需濃度，加入微量冰乙酸(終濃度不超過0.1%)，將CVB-D全部溶解，pH在6.5左右。尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測試盒、肌酐(creatinine，SCr)測試盒、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)酶測試盒:南京建成生物工程研究所;大鼠尿液β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)，免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)，視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)，微量白蛋白(microalbumin，mAlb)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TRF)測試盒:美國ADL羊抗鼠β2-microglobulin ELISA測定試劑盒，Lot No.RT110371;大鼠血清Tamm Horsfall蛋白(Tamm Horsfall protein，THP)和 β2-MG測試盒:美國 ADL羊抗鼠β2-microglobulin ELISA測定試劑盒，Lot No.RT110371。AY120型電子天平:日本 Shimadzu公司;Vital-200全自動(dòng)生化分析儀:荷蘭威圖科學(xué)儀器公司;全自動(dòng)尿液分析儀:日本Sysmex公司;80-2型臺(tái)式離心機(jī):上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠。

1.2 動(dòng)物分組和給藥

大鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫20～25℃，每天人工光照12 h，室內(nèi)通風(fēng)良好，實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度為65%～70%。

SD大鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組30只大鼠。正常對(duì)照組:PBS溶液(含0.1%的冰乙酸);CVB-D 2.5，5 和10 mg·kg－1，相當(dāng)于人用量的25，50 和100 倍;給藥體積為5 ml·kg－1。大鼠ip給予CVB-D，連續(xù)給藥2個(gè)月，分別在首次給藥后第1個(gè)月末和第2個(gè)月末每組取10只大鼠，雌雄各半，觀察并檢測各項(xiàng)指標(biāo)。2個(gè)月后各組留10只大鼠，停藥觀察4周，做同樣檢查。

1.3 一般檢查及血液、尿液生化指標(biāo)測定

每天觀察并記錄動(dòng)物的一般活動(dòng)及精神狀態(tài);每隔2 d稱量1次體重以及攝食量，觀察體重與攝食量的動(dòng)態(tài)變化。分別在第1個(gè)月末、第2個(gè)月末以及恢復(fù)期末，各組取10只大鼠，通過眼眶取血3 ml于促凝管中，分離血清，檢測 BUN，SCr，THP，β2-MG;并且收集24 h尿液，測定NAG，IgG，RBP，mAlb，TRF和 THP。

1.4 組織病理學(xué)檢查

第1個(gè)月和第2個(gè)月末以及恢復(fù)期分3批處死大鼠，對(duì)腎臟進(jìn)行肉眼檢查，稱重，用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般體征

大鼠ip給予CVB-D 2周后，體重出現(xiàn)增長緩慢現(xiàn)象。CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠在給藥4周后出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、精神不振、呼吸急促、體重增長緩慢的現(xiàn)象，其中有2只大鼠在給藥6周后出現(xiàn)大便稀溏的現(xiàn)象，并有1只大鼠在給藥5周后死亡。各組攝食量均在正常范圍內(nèi)。上述現(xiàn)象在恢復(fù)期得到改善，體重也出現(xiàn)明顯增長的現(xiàn)象，精神狀態(tài)也逐漸好轉(zhuǎn)。

2.2 環(huán)維黃楊星D對(duì)大鼠血清中尿素氮、肌酐、β2微球蛋白和Tamm Horsfall蛋白的影響

如表1所示，CVB-D ip給予大鼠1個(gè)月后，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠血清中的BUN含量與正常對(duì)照組相比明顯升高(P ＜0.01)。CVB-D 2.5，5和 10 mg·kg－1組的β2-MG含量均比正常對(duì)照組明顯升高(P ＜0.01)，CVB-D 5 和10 mg·kg－1組的 THP 含量比正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。給藥2個(gè)月后，CVB-D 5和10 mg·kg－1組大鼠血清中β2-MG含量比正常對(duì)照組顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 5 mg·kg－1組大鼠血清中的BUN含量比正常對(duì)照組顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠血清中的 THP含量比正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。在恢復(fù)期內(nèi)，CVB-D 5 mg·kg－1組大鼠血清中的 SCr含量比正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。

2.3 環(huán)維黃楊星D對(duì)大鼠尿酶及尿液中微量蛋白的影響

CVB-D ip給予大鼠1個(gè)月后，與正常對(duì)照組相比，CVB-D 10 mg·L－1組大鼠尿液中 NAG，TRF，β2-MG和IgG 含量顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 5和10 mg·kg－1組的尿液mAlb含量及RBP含量顯著升高(P＜0.05，P ＜0.01)。給藥 2 個(gè)月后，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠尿液中NAG和IgG含量比正常對(duì)照組顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，CVB-D 5和 10 mg·kg－1組大鼠尿液中的β2-MG和TRF含量比正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)。在恢復(fù)期內(nèi)，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠尿液中mAlb和TRF含量比正常對(duì)照組顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 2.5 mg·kg－1組 mAlb含量比正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)(表2)。

表1 環(huán)維黃楊星D(CVB-D)對(duì)大鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、β2微球蛋白(β2-MG)、Tamm Horsfall蛋白(THP)的影響Tab.1 Effect of cyclovirobuxine D(CVB-D)on blood urea nitrogen(BUN)，creatinine(SCr)，β2-microglobulin(β2-MG)and Tamm Horsfall protein(THP)in rats

表2 CVB-D對(duì)大鼠尿酶及尿液中微量蛋白的影響Tab.2 Effect of CVB-D on concent of urease and protein in urine of rats

2.4 環(huán)維黃楊星D對(duì)大鼠腎臟組織病理的影響

肉眼觀察可見給藥1個(gè)月的大鼠腎臟組織未見異常，給藥2個(gè)月及恢復(fù)期CVB-D 10 mg·kg－1組部分大鼠腎臟顏色由暗紅變?yōu)榘迭S色，質(zhì)地變硬，其余未見異常。由圖1組織學(xué)檢查可見，正常對(duì)照組中腎臟組織學(xué)改變大致正常，未見明顯病理改變。CVB-D 2.5 mg·kg－1組給藥 1 個(gè)月有 2 例動(dòng)物見腎間質(zhì)內(nèi)數(shù)量不等炎細(xì)胞浸潤。CVB-D 2.5 mg·kg－1組給藥2個(gè)月有2例動(dòng)物見腎臟化膿性炎癥，部分腎小球和腎小管壞死，1例動(dòng)物見腎間質(zhì)內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤;CVB-D 5和10 mg·kg－1組分別有1例和2例動(dòng)物見腎臟包膜增厚，包膜下少量炎細(xì)胞浸潤，并且有部分動(dòng)物出現(xiàn)腎臟組織自溶現(xiàn)象;恢復(fù)期中各劑量組均有部分動(dòng)物見腎間質(zhì)內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤，少數(shù)動(dòng)物腎間質(zhì)內(nèi)淤血明顯。

圖1 CVB-D對(duì)大鼠腎臟組織病理變化的影響 (HE×200).A:給藥1個(gè)月正常對(duì)照組，腎組織結(jié)構(gòu)正常;B:給藥1個(gè)月CVB-D 2.5 mg·kg－1組，腎間質(zhì)炎癥，細(xì)胞浸潤;C:給藥2 個(gè)月CVB-D 2.5 mg·kg－1組，腎化膿性炎癥 ;D:給藥2 個(gè)月CVB-D 10 mg·kg－1組腎包膜炎;E:恢復(fù)期 CVB-D 2.5 mg·kg－1組腎間質(zhì)炎癥.Fig 1. Effect of CVB-D on pathology of kidney in rats(HE×200).

3 討論

藥代動(dòng)力學(xué)研究和早期的毒性實(shí)驗(yàn)均顯示CVB-D在體內(nèi)有蓄積作用，且腎臟為分布濃度較高的臟器之一，也是CVB-D的主要排泄器官。其次，已有的犬長期毒性實(shí)驗(yàn)中，有動(dòng)物在觀察期內(nèi)的BUN升高，死亡的犬尿中出現(xiàn)蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及貧血的現(xiàn)象。家兔的長期毒性實(shí)驗(yàn)中，大劑量組部分動(dòng)物遠(yuǎn)曲小管及享勒袢起始部位黃色素沉著，遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞核固縮，胞漿有嗜酸性變。均提示CVB-D對(duì)腎有影響的可能［1］。前期的研究顯示，在SPF級(jí)大鼠和比格犬上，連續(xù)注射給藥后，較大劑量組部分動(dòng)物有明顯腎臟毒性反應(yīng)，尿中見有蛋白、上皮細(xì)胞及少量管型;血液生化中BUN明顯高于正常對(duì)照組;腎臟見有遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞變性、壞死及蛋白管型等病理損傷改變［4］。

尿TRF的升高是腎小球電荷屏障受損的標(biāo)志［5］。血清β2-MG的升高一般認(rèn)為是腎小球?yàn)V過功能受損或?yàn)V過負(fù)荷是否增加的情況;而尿液中排出β2-MG增高，則提示腎小管損害或?yàn)V過負(fù)荷增加。尿液中mAlb和IgG的含量增加均可作為腎小球損傷的敏感指標(biāo)，其中mAlb測定對(duì)早期腎損害的監(jiān)測價(jià)值已被公認(rèn)，現(xiàn)常把它作為糖尿病、高血壓早期腎損害的一個(gè)敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠ip給予CVB-D后尿液中的 TRF［5］，mAlb和 IgG的含量以及血清中β2-MG的含量比正常對(duì)照組均明顯增加，具有顯著性差異，且呈量效關(guān)系。同時(shí)，通過腎組織病理切片發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CVB-D給藥2個(gè)月后，CVB-D 2.5 mg·kg－1組部分大鼠出現(xiàn)腎小球壞死的現(xiàn)象?？梢?，CVB-D 長期 CVB-D 2.5 mg·kg－1應(yīng)用可能導(dǎo)致腎小球?yàn)V膜屏障的損傷。

尿液中NAG酶，RBP和β2-MG含量的增加以及THP含量的減少均可作為近端腎小管受損的敏感指標(biāo)［6－7］。在本實(shí)驗(yàn)中以上指標(biāo)的含量均隨著劑量的增加及時(shí)間的延長而明顯升高，與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異。這些指標(biāo)均與血清中BUN和SCr呈相關(guān)性。同時(shí)在給藥1和2個(gè)月后動(dòng)物出現(xiàn)了腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，給藥2個(gè)月后部分動(dòng)物出現(xiàn)了腎小管壞死的現(xiàn)象。CVB-D大劑量及長期給藥可能損傷近段腎小管以及導(dǎo)致急性間質(zhì)性腎炎的現(xiàn)象。

在恢復(fù)期，血清及尿液中仍有部分指標(biāo)顯著高于正常對(duì)照組，病理組織切片顯示 CVB-D 2.5 mg·kg－1組仍有部分單位出現(xiàn)腎間質(zhì)內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤或不同程度淤血的現(xiàn)象?？梢奀VB-D致腎毒性病變在停藥后無法徹底恢復(fù)。

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