何 欣，趙興華，歐陽(yáng)五慶

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)醫(yī)藥系，河北定州 073000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，陜西楊凌 712100)

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛、性涼，大毒，歸肝腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛和殺蟲(chóng)解毒等功效［1］。雷公藤多苷由雷公藤的根(去皮)經(jīng)粉碎、提取和精制而成，難溶于水，具有顯著的抗炎和免疫抑制作用，臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、慢性腎炎和皮膚病等，但在使用過(guò)程中對(duì)肝臟、腎臟、生殖系統(tǒng)和造血系統(tǒng)等毒性較大，這大大限制了其臨床應(yīng)用［2］。納米乳是一種新型藥物載體，可以增強(qiáng)藥物的溶解性，顯著提高藥物的生物利用度，促進(jìn)藥物透皮吸收，提高藥效，降低藥物的毒性作用［3－4］。

本實(shí)驗(yàn)室已研究報(bào)道，雷公藤多苷納米乳給藥28 d，大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)活性及尿素氮含量低于給予雷公藤多苷片，接近正常對(duì)照組水平;肝組織病理學(xué)觀察亦顯示雷公藤多苷納米乳組肝組織病理變化較雷公藤多苷片組輕［5］。為進(jìn)一步觀察用納米乳作為載體對(duì)雷公藤多苷進(jìn)行包合是否可以降低雷公藤多苷的肝腎細(xì)胞毒性，本研究觀察了雷公藤多苷納米乳體外對(duì)大鼠原代肝、腎細(xì)胞的毒性作用，為擴(kuò)大其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

Sprague-Dawley(SD)乳大鼠，7日齡，清潔級(jí)，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(軍)2002-005。雷公藤多苷，純度為98%，山東魯南貝特制藥有限公司;雷公藤多苷片，黃石飛云制藥有限公司，批號(hào):20060117;藥用級(jí)聚氧乙烯氫化蓖麻油(ethoxylated hydrogenated castor oil RH-40，RH-40)、肉豆蔻酸異丙酯(iso-propyl myristate，IPM)和藥用級(jí)聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylene castor oil，EL-40)，德國(guó) BASF公司;聚山梨酯80(Tween-80)和藥用石蠟油，天津南開(kāi)化工廠;DMEM培養(yǎng)基和膠原Ⅱ型酶，Gibco公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào):071010，經(jīng)56℃，30 min滅活后保存于 －20℃?zhèn)溆?胰酶消化液:碧云天生物技術(shù)研究所，C0201;二甲亞砜，Amresco公司。HITACHI高效液相色譜儀，日本日立電子公司;JEM1230透射電子顯微鏡，日本日立公司;馬爾文激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;XDS-1B型倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠;CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司;Model550酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司;MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司;FA1104型電子天平，上海天平儀器廠;ILAB600型全自動(dòng)系列生化分析儀，日本島津公司。

1.2 雷公藤多苷納米乳的制備及基本理化性質(zhì)評(píng)價(jià)

高效液相色譜儀測(cè)定雷公藤多苷在4種油(IPM、大豆油、藥用石蠟油和橄欖油)以及3種表面活性劑(EL-40，RH-40和Tween-80)中的溶解度，根據(jù)納米乳的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［6］，利用序貫設(shè)計(jì)思想，采用滴定法繪制偽三元相圖，確定出納米乳的最佳組成，制備雷公藤多苷納米乳。肉眼觀察雷公藤多苷納米乳及空白納米乳的外觀。根據(jù)文獻(xiàn)［6］方法，用透射電鏡觀察納米乳形態(tài)。馬爾文粒度分析儀測(cè)定其粒徑。

1.3 雷公藤多苷片的抽提和純化

因?yàn)槔坠俣嘬掌瑒┲休o料太多，若直接加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，會(huì)影響觀察和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以本研究對(duì)雷公藤多苷片進(jìn)行了簡(jiǎn)單抽提純化處理，并根據(jù)雷公藤多苷片中有效成分雷公藤多苷進(jìn)行定量。

1.4 大鼠原代細(xì)胞的制備和培養(yǎng)

1.4.1 肝細(xì)胞

參考門(mén)靜脈插管二步灌注法［7］，因?yàn)榭紤]到本次實(shí)驗(yàn)中用的是乳大鼠，門(mén)靜脈灌注難度較大，故選擇心臟灌注，以除去肝臟中的血液。當(dāng)看到肝臟呈土黃色時(shí)，停止灌注。仔細(xì)分離肝臟，PBS清洗2～3次并剪碎，邊剪邊用PBS洗滌，肝組織(約1 mm3)置于0.05%的膠原酶消化液中，37℃約15 min，消化結(jié)束后，用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，去除上清。低速離心法(40×g，1～2 min)清洗細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞，制成肝細(xì)胞懸液。經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色測(cè)定，細(xì)胞存活率＞90%。將肝細(xì)胞密度調(diào)整為(2～4)×108L－1，分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶中。

1.4.2 腎上皮細(xì)胞

采用膠原Ⅱ型酶和胰蛋白酶二步消化法［8］制備腎上皮細(xì)胞。小心剝離腎包膜，將腎組織剪碎并移入離心管中，加入足量Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴中消化，每隔5 min用吸管反復(fù)吹打消化液，直至組織塊消化完全。經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾以去除殘余的組織塊，再以40×g，離心5 min，傾去上清。在沉淀中加入足量的胰蛋白酶消化液，37℃水浴消化5～10 min，加入含10%血清的培養(yǎng)液終止消化。將上述細(xì)胞懸液置于離心管中，103×g離心5 min，棄掉上清，在沉淀中加入培養(yǎng)液，用吸管將沉淀輕輕吹起。細(xì)胞計(jì)數(shù)后取適量細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用倒置相差顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)24 h細(xì)胞從周邊貼壁生長(zhǎng)，48 h細(xì)胞鋪滿瓶底，細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，鵝卵石排列。

1.5 細(xì)胞存活率的測(cè)定

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2×108L－1接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100μl。將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，分別加入空白納米乳溶液、雷公藤多苷片和雷公藤多苷納米乳溶液各100 μl，藥物終濃度為0(培養(yǎng)液對(duì)照)，2，8，32，128 和 512 mg·L－1;同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，只加等體積的培養(yǎng)液，不加細(xì)胞，用于檢測(cè)本底。雷公藤多苷納米乳和雷公藤多苷片和空白納米乳用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配制。在37℃，5%CO2及飽和濕度條件下，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μl MTT 5 g·L－1溶液。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇波長(zhǎng)570 nm，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收度(absorbance，A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=(A待測(cè)藥物－ A空白對(duì)照)/(A培養(yǎng)液對(duì)照－ A空白對(duì)照)×100%。再用作圖法和直線回歸分析計(jì)算出待測(cè)藥物抑制細(xì)胞存活的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2×108L－1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl;將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h;將含不同濃度(空白納米乳溶液、雷公藤多苷片和雷公藤多苷納米乳溶液各100μl，使藥物終濃度為2，32和512 mg·L－1)待測(cè)藥物的培養(yǎng)液分別加入肝細(xì)胞或腎細(xì)胞的培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液，離心取上清，用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，GOT 和GPT。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雷公藤多苷納米乳的理化性質(zhì)

由雷公藤多苷在各種表面活性劑和油中的溶解度可知，雷公藤多苷在RH-40和IPM中的溶解度均較大，可以滿足藥物增溶的需要，且以RH-40為表面活性劑，IPM為油相時(shí)，納米乳形成區(qū)域最大，形成的納米乳最穩(wěn)定，最終納米乳的配方確定為RH-40∶IPM∶水，質(zhì)量比為 27∶3.3∶69.7。

在油和表面活性劑的混合體系中加入經(jīng)過(guò)研磨的雷公藤多苷原料藥，制備的雷公藤多苷納米乳呈棕黃色，澄清，透明，流動(dòng)性良好。由透射電子顯微鏡觀察顯示納米乳粒子大多數(shù)呈圓球形，分散性良好。馬爾文激光粒度分析儀測(cè)定制備的雷公藤多苷納米乳的平均粒徑為23.6 nm，多分散性系數(shù)為0.124，表明納米乳粒徑的分布范圍比較窄，粒徑比較均勻。

2.2 雷公藤多苷納米乳對(duì)乳大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性作用

由圖1可以看出，空白納米乳對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，雷公藤多苷納米乳和雷公藤多苷片明顯抑制原代肝細(xì)胞存活，雷公藤多苷納米乳的 IC50為 128.8 mg·L－1，雷公藤多苷片的 IC50為48.6 mg·L－1。由表1可以看出，雷公藤多苷納米乳組和雷公藤多苷片組細(xì)胞培養(yǎng)液中GPT，GOT和LDH 活性顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，所有濃度與空白納米乳組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。雷公藤多苷片2 和32 mg·L－1組的GPT，GOT和LDH活性高于對(duì)應(yīng)濃度雷公藤多苷納米乳組。表明雷公藤多苷納米乳和雷公藤多苷片對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞有毒性，且前者對(duì)肝細(xì)胞毒性強(qiáng)于后者。

圖1 雷公藤多苷納米乳對(duì)大鼠肝細(xì)胞存活率的影響.藥物體外作用大鼠肝細(xì)胞24 h.用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活.細(xì)胞存活率(%)=(A待測(cè)藥物－A空白對(duì)照)/(A培養(yǎng)液對(duì)照－A空白對(duì)照)×100%.±s，n=3.Fig.1 The effect of Tripterygium wilfordii glycoside nanoemulsion on primary cultured hepatic cells survival rate.

2.3 雷公藤多苷納米乳對(duì)乳大鼠腎細(xì)胞的毒性作用

由圖2可以看出，空白納米乳對(duì)大鼠原代腎細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，雷公藤多苷納米乳和雷公藤多苷片明顯抑制原代腎上皮細(xì)胞存活，雷公藤多苷納米乳的 IC50為 61.7 mg·L－1，雷公藤多苷片的 IC50為19.5 mg·L－1。由表2可以看出，雷公藤多苷納米乳組和雷公藤多苷片32和512 mg·L－1組細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT和LDH活性明顯高于空白納米乳組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明藥物對(duì)腎細(xì)胞有毒性作用。雷公藤多苷片組的GOT和LDH活性高于相應(yīng)濃度雷公藤多苷納米乳組，表明雷公藤多苷納米乳的腎上皮細(xì)胞毒性強(qiáng)于雷公藤多苷片。

表1 雷公藤多苷納米乳對(duì)大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響Tab.1 Effect of Tripterygium wilfordii glycoside nanoemulsion on glutamicoxaloacetic transaminase(GOT)，glutamicpyruvic transaminase(GPT)and lactate dehydrogenase(LDH)activities in primary cultured hepatic cells

圖2 雷公藤多苷納米乳對(duì)大鼠腎細(xì)胞存活率的影響.藥物體外作用大鼠肝細(xì)胞24 h.用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活.細(xì)胞存活率(%)=(A待測(cè)藥物 －A空白對(duì)照)/(A培養(yǎng)液對(duì)照 －A空白對(duì)照)×100%.xˉ±s，n=3.Fig.2 Effect of T.wilfordii glycoside nanoemulsion on primary cultured renal cells survival rate.

表2 雷公藤多苷納米乳對(duì)大鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT和LDH活性的影響Tab.2 Effect of T.wilfordii glycoside nanoemulsion on GOT and LDH activities in primary cultured renal cells

3 討論

雷公藤多苷所引起的急性肝損傷主要表現(xiàn)為似急性病毒性肝炎或無(wú)黃疸型肝炎，多數(shù)患者有單項(xiàng)GPT升高的癥狀，提示雷公藤所致肝損傷以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷為主［9］。GOT和GPT是目前臨床上最常用的肝功能指標(biāo)，主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)。如果肝細(xì)胞壞死，GOT和GPT就會(huì)升高，其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，因此細(xì)胞活性越低，GOT和GPT在培養(yǎng)液中的含量越高。LDH是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，相同劑量時(shí)雷公藤多苷片作用下的肝細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT，GPT和LDH的含量比雷公藤納米乳作用下的要高，說(shuō)明在相同劑量下，片劑對(duì)肝細(xì)胞的毒性更大。這一點(diǎn)由藥物對(duì)肝細(xì)胞的IC50也可以得到證實(shí)，雷公藤多苷片對(duì)肝細(xì)胞的 IC50為48.6 mg·L－1，雷公藤多苷納米乳對(duì)肝細(xì)胞的 IC50為128.8 mg·L－1，后者是前者的 2.65 倍。

雷公藤腎損害多為急性腎損害，呈現(xiàn)急性腎衰竭，尤其過(guò)量用藥時(shí)發(fā)生率尤高［10］。本研究結(jié)果顯示，雷公藤多苷片作用下的腎細(xì)胞培養(yǎng)液中這兩種酶的含量比相同劑量下雷公藤多苷納米乳組中的含量高，證明雷公藤多苷片的腎毒性較強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算，雷公藤多苷片對(duì)腎細(xì)胞的 IC50為19.5 mg·L－1，雷公藤多苷納米乳對(duì)肝細(xì)胞的 IC50為61.7 mg·L－1，后者是前者的3.16倍。

本實(shí)驗(yàn)室前期觀察大鼠體內(nèi)毒性結(jié)果表明，雷公藤多苷納米乳給藥28 d血清GOT和GPT活性及尿素氮含量比雷公藤多苷片組低，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異;肝組織病理學(xué)觀察顯示，雷公藤多苷納米乳組肝小葉放射狀結(jié)構(gòu)基本清晰，肝細(xì)胞稍有腫脹;腎小管細(xì)胞輕微腫脹，有的細(xì)胞脫落或者發(fā)生溶解;雷公藤多苷片組肝細(xì)胞索紊亂，放射狀排列消失，細(xì)胞變形，胞漿有的呈現(xiàn)空泡狀，肝細(xì)胞之間炎性細(xì)胞增多，腎小管上皮增厚，細(xì)胞腫脹、脫落，腎小管間質(zhì)中有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腎小球上皮細(xì)胞增生，甚至與囊壁發(fā)生粘連［5］。結(jié)合本研究體外肝、腎細(xì)胞毒性研究結(jié)果表明，雷公藤多苷納米乳比雷公藤多苷片的肝腎細(xì)胞毒性小，用納米乳對(duì)雷公藤多苷進(jìn)行包合降低了其對(duì)肝臟和腎臟的毒性作用，這為擴(kuò)大雷公藤多苷在臨床上的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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