張 鑫，袁 蘭，楊秀偉，焦士勇，王 旗

(北京大學1.公共衛(wèi)生學院毒理系，2.醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心，3.藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191)

七葉皂苷(aescin)是七葉樹(Aesculus chinensis Bge.)或天師栗(Aesculus wilsonii Rehd.)的干燥成熟種子(總稱娑羅子)中提取的多種皂苷的總稱，主要包括4種成分:A和B為β-七葉皂苷，C和D為α-七葉皂苷，它們有共同的三萜皂苷元母核，由于各自側鏈不同而藥理活性不同［1］。七葉皂苷具有抗炎、抗?jié)B出、增強靜脈張力和抗腫瘤等多種藥理活性，在臨床上廣泛用于燒傷、腦水腫和血管疾病等的治療［2－4］。但在臨床應用中發(fā)現，七葉皂苷過量使用可導致急性腎功能衰竭［5］，本課題組的體外研究也證實，七葉皂苷對人腎近曲小管上皮細胞具有明顯毒性，且不同的組分毒性存在顯著差異，而抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)對七葉皂苷30及60 μmol·L－1引起的細胞損傷具有拮抗作用，提示七葉皂苷可能通過氧化應激途徑發(fā)揮細胞毒性作用［6］。

為進一步研究七葉皂苷的腎毒性作用機制與氧化應激的關系，本研究以人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)為模型檢測了七葉皂苷鈉(sodium aescinate，SA)作用于細胞后，胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)與抗氧化物質GSH的含量變化，并分別用 GSH合成前體 N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)或抑制劑丁硫氨酸亞砜亞胺(L-buthionine-sulfoximine，BSO)控制細胞內的GSH合成狀態(tài)，進而觀察GSH對SA的細胞毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

SA注射劑由山東煙臺綠葉制藥有限公司生產;D/F12(DMEM∶F12=1∶1)培養(yǎng)基(北京清大天一生物科技有限公司);胎牛血清(美國 MDgenics公司);1∶250胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT，Amresco)和NAC均購自北京拜爾迪生物技術有限公司;BSO(純度≥99.0%)購自上海晶純實業(yè)有限公司;谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒及活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)購自碧云天生物技術研究所;其余試劑為國產分析純。

1.2 儀器

HERAcell 250二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Herus Cell公司;TE2000-S倒置顯微鏡，DXM1200F數字攝像機，日本Nikon公司;SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;Multiskan MK3型酶標儀，美國Thermo公司;電子精密天平，美國奧豪斯集團;TCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

HK-2細胞購自北京協(xié)和醫(yī)科大學，采用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)液由D/F12粉配制，另含10%胎牛血清，青霉素100 kU·L－1及鏈霉素100 kU·L－1。在 CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2，恒濕)條件下培養(yǎng)，80%融合后以胰蛋白酶/EDTA消化液消化，3～4 d傳代1次，采用對數生長期的細胞進行實驗。

1.4 熒光探針法測定細胞內活性氧

取生長融合達80%以上的HK-2細胞，用濃度為0.05%的胰蛋白酶消化液消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為3×105L－1接種至35 mm玻璃薄底培養(yǎng)皿，每皿200μl，于恒濕、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液。細胞分為正常對照，H2O2陽性對照與 SA 10，15，20 和 25 μmol·L－1組，分別在H2O210 min處理及SA處理2 h后棄去皿內上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2 遍，以DCFH 10 μmol·L－1稀釋液(由不含血清的DMEM/F12稀釋)裝載細胞，37℃避光孵育30 min后棄去含DCFH培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍后加入Hank液，于激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光強度(激發(fā)波長484 nm，發(fā)射波長520 nm)，Leica Confocal軟件做圖像處理，細胞內ROS含量用藥組灰度值與對照組灰度值的比值表示。

1.5 DTNB比色法檢測細胞內谷胱甘肽含量

取生長融合達80%以上的HK-2細胞，用濃度為0.05%的胰蛋白酶消化液消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為2.5×105L－1，接種至6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，于恒濕、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

實驗分為正常對照，NAC及BSO預處理組:正常對照組加入不含血清的細胞培養(yǎng)液，NAC和BSO組分別加入 NAC 1，5 和 10 mmol·L－1或 BSO 0.5 和2.5 mmol·L－1的無血清培養(yǎng)液，濃度設計參考 Shen等［7］的報道，處理4 h后測定GSH含量;然后加入SA 20 μmol·L－1作用細胞24 h，再測定細胞內GSH 含量。測定方法參照碧云天GSH試劑盒說明書，于405 nm處測定樣品及標準品的吸光度值(A405nm)并根據標準曲線計算HK-2細胞的GSH含量。

1.6 MTT法檢測HK-2細胞存活

取生長融合達80%以上的細胞用0.05%胰蛋白酶消化液消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1.5 ×105L－1，每孔200 μl接種于 96 孔培養(yǎng)板。于恒濕、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液。實驗分為正常對照組:加入不含血清的培養(yǎng)液;NAC組:加入 NAC 5 mmol·L－1;BSO 組:加入BSO 2.5 mmol·L－1對細胞進行預處理。4 h 后棄去孔內的上清液，分別在上述3個預處理組加入SA 0，10，15，20，25，30 和 40 μmol·L－1，每孔 100 μl，每一濃度組設5個復孔，于恒濕，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

24 h后棄去孔內上清液，每孔加入100μl含有MTT的培養(yǎng)液(0.5 g·L－1)，37℃孵育 4 h 后棄去孔內上清液，加入酸性異丙醇(按異丙醇∶1 mmol·L－1HCl溶液體積比96∶4配制)，充分震蕩混勻后37℃放置30 min，于570 nm處測定吸光度值(A570nm)并計算HK-2細胞的相對存活率，相對存活率(%)=A藥物組/A對照組×100%。用 Origin 8.0擬合曲線并計算半數抑制濃度IC50。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 七葉皂苷鈉誘導HK-2細胞內活性氧的生成

圖1所示為激光共聚焦顯微鏡下觀察的HK-2細胞染色情況，綠色熒光物質為經 ROS氧化的DCF，熒光強度的不同反映了細胞內ROS的含量變化。正常對照組(圖1A)熒光強度最低，陽性對照組經H2O2處理10 min后，細胞內的熒光強度明顯增高(圖 1B，表 1)(P ＜0.01)，SA 12，20和 25 μmol·L－1各組熒光強度也顯著高于正常對照組(P ＜0.01，P ＜0.05)，且隨著濃度增加而逐漸增強(圖1C ～F)。但SA 25 μmol·L－1的熒光強度較前一組有所減弱，推測可能是ROS含量的增高激發(fā)了細胞內的抗氧化反應。

圖1 七葉皂苷鈉(SA)對HK-2細胞活性氧(ROS)含量的影響.A:正常對照;B:H2 O2;C～F:SA 10，15，20和25μmol·L－1.Fig.1 Effect of sodium aescinate(SA)on reactive oxygen species(ROS)generation in HK-2 cells.

表1 SA對HK-2細胞內活性氧(ROS)含量的影響Tab.1 Effect of SA on ROS generation in HK-2 cells

2.2 七葉皂苷鈉對丁硫氨酸亞砜亞胺和N-乙酰-L-半胱氨酸預處理后的HK-2細胞內谷胱甘肽含量的影響

如表 2所示，與正常對照組相比，BSO 2.5 mmol·L－1處理4 h后細胞內 GSH含量顯著降低(P ＜0.05)，而 BSO 0.5 mmol·L－1與 NAC 1 和 5 mmol·L－1處理后細胞內的GSH含量與正常對照組相比均無明顯差異，說明 BSO 2.5 mmol·L－1處理4 h可有效抑制細胞內 GSH合成。NAC 10 mmol·L－1預處理后細胞內 GSH含量也明顯降低(P＜0.05)，可能與過高濃度的NAC引起細胞毒性作用有關。

經上述預處理后再分別加入SA 20μmol·L－1作用24 h，除 NAC 10 mmol·L－1預處理組外，其余各組在SA作用后細胞內的GSH含量均顯著降低(P ＜0.01)。

表2 SA對N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)預處理后的谷胱甘肽(HK-2)細胞內GSH含量的影響Tab.2 Effects of SA on glutathione(GSH)content in HK-2 cells after N-acetyl-L-cysteine(NAC)and L-buthionine-sulfoximine(BSO)pretreatment

2.3 七葉皂苷鈉對N-乙酰-L-半胱氨酸和丁硫氨酸亞砜亞胺預處理后的HK-2細胞存活的影響

圖2結果顯示，SA對HK-2細胞有明顯的毒性作用，HK-2細胞的相對存活率隨藥物濃度增加而逐漸降低，SA作用HK-2細胞24 h的IC50為(31.3±1.7)μmol·L－1。BSO 2.5 mmol·L－1預處理后 SA 20，25 和30 μmol·L－1作用細胞的相對存活率分別為(69±6)%，(40±13)%和(25±15)%，顯著低于同濃度未經預處理組〔(83±5)%，(69±5)%和(54 ±6)%)〕(P ＜0.05)，IC50值為(23.6 ±2.7)μmol·L－1，與未預處理組相比明顯降低(P ＜0.05)。NAC預處理后各濃度SA的HK-2細胞相對存活率與同濃度未經預處理組相比無顯著變化，IC50為(34.2 ±1.5)μmol·L－1，與未預處理組相比無顯著變化。

圖2 SA對NAC和BSO預處理后的HK-2細胞存活的影響.NAC 5 mmol·L－1或BSO 2.5 mmol·L－1預處理 HK-2 細胞4 h 后加入 SA 20 μmol·L－1作用24 h.細胞存活率(%)=A藥物組 /A對照組 ×100%.s，n=3.*P＜0.05，與SA組相比.Fig.2 Effect of SA on HK-2 cell survival pretreated with NAC and BSO.

3 討論

正常生理狀態(tài)下，細胞內的氧化與抗氧化系統(tǒng)維持動態(tài)平衡。但當毒物刺激細胞產生過量的ROS，超過抗氧化系統(tǒng)的代償能力時，可對細胞造成氧化損傷。腎臟是體內藥物代謝、排泄的重要器官，更易受到有毒物質的氧化損傷，因此維持細胞內的谷胱甘肽水平對腎臟細胞抵御外源化學物的氧化損傷有重要作用，當細胞內GSH含量降低不足以維持氧化還原平衡時，可明顯增加外源化學物的毒性［8－9］。此外，近曲小管上皮細胞中的一些代謝酶也需要依賴GSH發(fā)揮藥物代謝與解毒作用。

谷胱甘肽在胞漿內的合成過程分為兩步，分別由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽合成酶催化，BSO可通過抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性顯著降低GSH的合成速度，抑制率達90%［10］。本研究采用 BSO 2.5 mmol·L－1與 HK-2 細胞孵育 4 h顯著降低了細胞內的GSH含量，在此基礎上進行的毒性實驗證實GSH含量降低可增加SA 20μmol·L－1的細胞毒性，提示細胞內源性的谷胱甘肽對拮抗七葉皂苷的細胞毒性有重要的作用。

半胱氨酸是GSH合成的底物，其濃度是影響GSH合成速度的決定因素。但在本研究中NAC 1，5和10 mmol·L－1預處理 HK-2細胞，胞漿內的 GSH含量相比對照組并無顯著升高，而且 NAC 5 mmol·L－1對SA的細胞毒性亦無顯著的保護作用。在本研究中NAC可能未能有效地提高HK-2細胞內的谷胱甘肽合成速度。采用體外分離的大鼠腎近曲小管上皮細胞研究也發(fā)現，GSH合成的氨基酸前體5 mmol·L－1與腎近曲小管上皮細胞孵育對胞漿內GSH含量無顯著影響，提示近曲小管細胞在氧化應激狀況下，合成GSH的主要方式是攝取細胞外的完整GSH而不是通過前體物質合成［11］。而SA促使HK-2細胞內ROS的生成增加，在此狀態(tài)下，補充NAC不能升高HK-2細胞內的谷胱甘肽含量。

綜合上述實驗結果表明，七葉皂苷可促進細胞內ROS生成，并加速消耗細胞內的抗氧化物質GSH，通過氧化應激途徑發(fā)揮細胞毒性作用，細胞內谷胱甘肽可拮抗七葉皂苷的毒性。其細胞保護的機制可能是GSH作為抗氧化劑清除七葉皂苷誘導產生的活性氧，從而減輕其對細胞的損傷。

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