王 菡，黃光照，鄭 娜，劉 良

(1.三亞市人民醫(yī)院病理科，海南三亞 572000;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院法醫(yī)學系，湖北武漢 430030)

雷公藤具有抗炎、免疫調節(jié)和抗生育等作用［1］。雷公藤甲素(triptolide，TP)是雷公藤的主要有效成分，具有較強的免疫抑制作用［2］，并用于抗器官移植排斥反應［3］。但 TP有很高的急性毒性［4］，服用中毒早期即可出現(xiàn)心功能障礙的癥狀，表現(xiàn)為心前區(qū)疼痛、血壓下降、心律失常，甚至出現(xiàn)頑固性心源性休克而發(fā)生急性循環(huán)衰竭［5］。本研究ig給予大鼠TP，制備大鼠TP急性中毒模型，觀察TP急性中毒大鼠心臟功能的變化和心肌組織病理學改變，探討TP心臟毒性作用，為TP中毒的臨床救治和毒理學研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和儀器

成年SD雄性大鼠60只，體重190～240 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(鄂)2007－0009。TP購自福建省醫(yī)學科研所，純度99%;濃縮型小鼠心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin T，CTn T)單克隆抗體和SP法免疫組化測定試劑盒購自福州邁新生物技術公司。BL-420E+生理功能實驗系統(tǒng)由同濟醫(yī)學院病理生理教研室提供。

1.2 雷公藤甲素半數(shù)致死量的測定

采用上下增減劑量法［6］測TP的LD50。將每次TP用量及大鼠的結局均輸入急性毒性實驗統(tǒng)計學軟件(AOT425StatPgm)，程序自動給出實驗的終點劑量。

1.3 動物分組及給藥

TP以少量丙二醇溶解，4℃冰箱保存，實驗時以生理鹽水稀釋至所需濃度。大鼠隨機分為正常對照組，TP 0.6，1.2 和2.4 mg·kg－1組，每組15 只;TP 一次性ig給予，給藥體積為10 ml·kg－1;正常對照組給予等體積生理鹽水。實驗前大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，給予TP前禁食12 h，自由進水，給藥后禁食4 h。

1.4 觀察大鼠表現(xiàn)及測定心電圖

給予TP后動態(tài)觀察各組大鼠的外觀體征、行為活動等一般情況。每組隨機取3只大鼠記錄心率改變。定時記錄Ⅰ導聯(lián)給藥前(記為－1 h)、給藥后15，16，18和20 h心電圖。連續(xù)測量5個心動周期，取其平均值。

1.5 血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測

每組隨機取5只大鼠，給藥前取血測定血清CK和LDH活性作為自身對照，3 d后ig給予TP，20 h后尾靜脈采血，Aeroset全自動生化分析儀檢測LDH和CK活性。

1.6 心肌組織病理學觀察

給予TP后72h處死大鼠，于心臟右心房下橫切取材，制成石蠟切片，HE染色觀察。采用全自動彩色圖像分析系統(tǒng)，對心肌損傷進行半定量分析。每組9只大鼠，每只3張切片，每張切片放大200倍，隨機取4個無重疊視野于鏡下觀察。將出現(xiàn)心肌細胞腫脹、空泡變性、溶解壞死和收縮帶壞死等病理改變的心肌損傷區(qū)域圈出，由圖像分析系統(tǒng)采集圈出部分的數(shù)據(jù)，測定每個視野心肌損傷面積占視野總面積的百分比，反映心肌損傷程度。

1.7 心肌超微結構變化的觀察

每組隨機取2只大鼠，用刀片于心耳下橫切面左心室近室間隔處取1～2 mm2心肌組織，2%戊二醛 (pH 7.4，4℃)固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察超微結構變化。

1.8 免疫組織化學法測定心肌肌鈣蛋白分布

按照試劑盒說明書用SP法進行CTn T免疫組化染色。從每組制備的石蠟切片中隨機選擇10張，經過烤片，脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O237℃孵育，PBS沖洗，正常羊血清工作液封閉后，滴加抗CTn T抗體4℃孵育過夜，DAB顯色。棕褐色為CTn T免疫陽性反應。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 雷公藤甲素的急性毒性

用急性毒性實驗統(tǒng)計學軟件AOT425StatPgm上下增減劑量法檢測結果表明，雄性大鼠ig給予TP，LD50值為 1.19 mg·kg－1，95% 可信區(qū)間為 1 ～1.75 mg·kg－1。

2.2 TP急性中毒大鼠一般癥狀和死亡率

給予TP后5 h，TP 1.2 和 2.4 mg·kg－1組大鼠活動度減低，反應遲鈍，食量減少甚至拒食，眼角分泌物增多。TP 2.4 mg·kg－1組大鼠出現(xiàn)抽搐、昏迷、死亡，死亡多發(fā)生在給藥后16～34 h，死前表現(xiàn)為畏縮不動，潮式呼吸，可持續(xù)3～4 h。給予TP后72 h，TP 0.6，1.2 和 2.4 mg·kg－1組大鼠分別死亡 1/15，8/15和14/15。

2.3 TP急性中毒大鼠心率和心電圖的改變

給予TP 后15 ～20 h，與對照組比較，0.6 mg·kg－1組大鼠心率無明顯變化，1.2 和2.4 mg·kg－1組心率明顯減慢(表1);檢測心電圖發(fā)現(xiàn)，TP 3個劑量組均可見S-T段壓低、T波高尖、Q波增寬和脫失等心電圖改變(圖1)。

2.4 TP急性中毒大鼠血清CK和LDH活性

與正常對照組相比，給予TP 20 h后，TP 0.6，1.2 和2.4 mg·kg－1組大鼠血清 CK 和 LDH 活性明顯升高(表2)，與 TP劑量呈正相關(r值分別為0.95和0.94，P ＜0.01)。

2.5 TP急性中毒大鼠心肌組織結構的改變

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，TP 0.6 mg·kg－1組可見灶性心肌細胞水腫(圖 2B)，TP 1.2 mg·kg－1組心肌細胞腫脹、空泡變性明顯(圖2C)，TP 2.4 mg·kg－1組除可見空泡變性外，還出現(xiàn)細胞溶解壞死和收縮帶壞死(圖2D)。如表3所示，與正常對照組相比，TP 0.6，1.2和2.4 mg·kg－1組心肌損傷面積百分比明顯升高，與 TP 劑量呈正相關(r值為0.80，P ＜0.01)。

表1 雷公藤甲素(TP)急性中毒對大鼠心率的影響Tab.1 Effect of acute triptolide(TP)poisoning on heart rate of rats

圖1 TP急性中毒大鼠心電圖的改變.動物處理見表1.大鼠ig給予TP后15～20 h檢測心電圖.A:正常對照;B，C和D:TP 0.6，1.2和 2.4 mg·kg－1.Fig.1 Electrocardiograms of rats with acute TP poisoning.

表2 TP急性中毒對大鼠血清肌酸激酶 (CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響Tab.2 Effect of TPacute poisoning on creatine kinase(CK)and lactate dehydrogenase(LDH)activities of rats

圖2 TP急性中毒大鼠心肌組織病理改變(HE×200).動物處理見表 1.A:正常對照;B:TP 0.6 mg·kg－1;C:TP 1.2 mg·kg－1，箭頭示心肌細胞腫脹;D:TP 2.4 mg·kg－1，箭頭示心肌細胞溶解壞死.Fig.2 Pathological changes in myocardium of rats with acute TP poisoning(HE ×200).

表3 TP急性中毒對大鼠心肌的損傷作用Tab.3 Effect of acute TP poisoning on myocardial damage of rats

2.6 TP急性中毒大鼠心肌超微結構的變化

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TP 0.6 mg·kg－1組可見細胞線粒體輕度腫脹，嵴減少，糖原顆粒減少(圖3B);TP 1.2 mg·kg－1組心肌纖維斷裂，線粒體明顯腫脹，伴空泡樣形成，嵴的數(shù)目亦明顯減少(圖3C);TP 2.4 mg·kg－1組肌小節(jié)亦有一定程度的斷裂，肌原纖維模糊，殘存線粒體結構消失(圖3D)。

2.7 TP急性中毒對大鼠心肌細胞CTn T表達的影響

如圖4所示，正常對照組心肌細胞胞漿內均呈彌漫棕褐色CTnT免疫陽性反應，縱切與橫切的心肌纖維中均明顯可見，未見灶缺失。TP 0.6 mg·kg－1組灶性心肌細胞胞質內棕褐色顆粒較淡，脫失;TP 1.2 mg·kg－1組局部心肌細胞胞質棕褐色顆粒較淡，少數(shù)缺染;TP 2.4 mg·kg－1組心肌細胞棕褐色顆粒缺染區(qū)擴大。

圖3 TP急性中毒大鼠心肌超微結構的變化.動物處理見表1.A:正常對照;B:TP0.6 mg·kg－1;C:TP1.2 mg·kg－1，箭頭示心肌細胞線粒體空泡化;D:TP 2.4 mg·kg－1，箭頭示心肌細胞肌原纖維斷裂.Fig.3 Effect of triptolide on myocardium ultrastructure by transmission electron microscope.

圖4 TP急性中毒對大鼠心肌細胞心肌鈣蛋白表達的影響 (免疫組化 ×200).動物處理見表1.A:正常對照，箭頭示心肌細胞均呈彌漫棕褐色陽性反應;B:TP 0.6 mg·kg－1;C:TP 1.2 mg·kg－1，箭頭示心肌細胞細胞胞質內棕褐色缺染;D:TP 2.4 mg·kg－1，箭頭示心肌細胞棕褐色顆粒缺染區(qū)擴大.Fig.4 Effect of triptolide on the expression of cardiac troponin T in myocardium(Immunohistochemistry ×200).

3 討論

有報道部分服TP者可見傳導阻滯、結性逸搏、S-T段下降、T波倒置等心臟受損的心電圖表現(xiàn)［7］。本實驗顯示，給TP后大鼠自發(fā)活動減少、共濟失調、呼吸抑制，出現(xiàn)明顯的心電異常，與臨床報道的心肌損害特征相似。

本實驗觀察到一次性給予TP后，大鼠血清心肌CK和LDH水平明顯升高，呈現(xiàn)對TP的劑量依賴;心肌損傷面積也隨TP劑量的增加而加大。提示TP的急性心臟毒性具有劑量相關性。HE染色結果顯示，TP所致急性心肌損傷的病理學改變以心肌細胞腫脹，空泡變性為主，心內膜下心肌改變最明顯，病變較重者全層心肌均可見。心肌的溶解壞死，病變范圍和程度隨著TP劑量的增加而加重。大劑量下還觀察到不同程度收縮帶壞死，輕者僅見于心外膜下心肌，重者心外膜、內膜下心肌均可見，呈條帶狀、結節(jié)狀分布。心肌收縮帶壞死又稱為凝固性肌溶性壞死，被認為是心肌急性缺血的形態(tài)學特征［8］，在其他中藥急性中毒的心肌也可觀察到［9］。給予TP后16 h，大鼠即出現(xiàn)明顯的心電異常，心動過緩、S-T段改變、Q波增寬、Q波缺失等心電圖表現(xiàn)，可能與TP造成急性心肌缺血，循環(huán)衰竭有關。

從超微結構看，TP造成的心肌細胞損傷以線粒體的變化最明顯。線粒體是心臟毒性常見的亞細胞靶點。Su等［10］報道 TP處理組的 Lewis肺癌細胞(LLC)染毒后4 h即可檢測到細胞線粒體轉換孔開放，線粒體膜去極化以及ATP生成障礙。本實驗觀察到TP中毒的心肌細胞早期即可出現(xiàn)線粒體腫脹，基質密度降低，劑量增大時可出現(xiàn)嵴紊亂、斷裂，線粒體空泡化，結構消失。由于線粒體結構和功能的改變，可以影響細胞呼吸鏈電子傳遞，使氧化磷酸化異常。而細胞能量代謝障礙，可加重細胞內ATP耗竭，使依賴ATP的離子泵和鈣轉運調節(jié)過程失調，導致細胞主動運輸障礙而引起細胞腫脹、空泡變性直至溶解壞死。

大鼠心肌CTn T免疫組化顯示，較高劑量TP引起心肌細胞中CTn T明顯缺失。CTn T是心肌的結構蛋白，也是一種檢測心肌損害高敏感和特異性標志物［11］。當心肌細胞損傷時，細胞膜破裂，胞漿內游離CTn T釋放，若損傷進一步加重，則CTn T與肌原纖維分離并持續(xù)釋放入血。Chen等［12］報道，TP之所以能夠使調控細胞骨架的基因B1247008以及調控鐵傳遞蛋白受體的基因BC054522表達上調，與TP破壞細胞骨架損傷細胞膜有關。由此可見，TP所致心肌損傷出現(xiàn)CTn T缺失可能與細胞膜性結構破壞有關。由于CTn T是維持心肌細胞正常收縮耦聯(lián)的關鍵蛋白［13］，CTn T缺失也意味著該區(qū)域心肌纖維結構毀壞，心肌功能喪失［14］。

綜上所述，TP的急性毒性與急性心肌損傷密切相關，且具有劑量相關性。心肌超微結構改變和CTn T缺失提示TP的心肌損傷作用可能與線粒體損傷、細胞膜破壞有關。

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