徐 黎 葉俊華 楊前勇 馬長(zhǎng)書(shū) 付平峰 李德貴 楊利國(guó)

谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多態(tài)性與犬行為性狀的關(guān)聯(lián)性分析

徐 黎 葉俊華 楊前勇 馬長(zhǎng)書(shū) 付平峰 李德貴 楊利國(guó)

興奮性氨基酸是廣泛存在于哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸興奮傳遞，學(xué)習(xí)記憶形成以及與多種神經(jīng)變性疾病有關(guān)。EAA包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）、亮氨酸等等。其中谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最高的氨基酸。目前有學(xué)者認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷中，興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的失衡，對(duì)激發(fā)興奮毒性起一定作用，故是造成腦損傷的因素之一。

γ氨基丁酸（GABA）與谷氨酸是一對(duì)重要的抑制與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，兩者的平衡對(duì)維持腦功能至關(guān)重要。細(xì)胞外液GLU濃度過(guò)高，對(duì)腦有損傷作用因改變血腦屏障通透性，從而導(dǎo)致腦組織損害。如果谷氨酸代謝發(fā)生改變，勢(shì)必會(huì)造成中樞神經(jīng)激發(fā)興奮性中毒，所以在谷氨酸代謝過(guò)程中，起到重要作用的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族對(duì)于保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有其重要的作用。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族包括：谷氨酸/天門氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（GLAST）、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因－1（GLT-1）、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因－3（EAAT3）、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因－4（EAAT4）和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因－5（EAAT5）。Niwako（2006）等利用直接測(cè)序的方法，在犬GLT-1基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了同義突變，分別統(tǒng)計(jì)了5個(gè)品種193只犬的基因型頻率，發(fā)現(xiàn)品種之間基因型頻率品種之間差異顯著。本文選擇谷氨酸/天門氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（GLAST）和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因－1（GLT-1）兩個(gè)基因系統(tǒng)作為犬行為候選基因，旨在希望獲得與犬行為密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為以后犬早期輔助選擇和犬指導(dǎo)訓(xùn)練奠定一定的理論基礎(chǔ)。

一、材料和方法

（一）試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

實(shí)驗(yàn)犬來(lái)自公安部南昌警犬基地，均為成年犬。品種有德國(guó)牧羊犬60條和羅維納犬68條 (表1-1)，所有實(shí)驗(yàn)犬前肢靜脈采血5ml，EDTA抗凝，-20℃保存。

表1-1 實(shí)驗(yàn)犬的品種、樣本數(shù)，性別和年齡

（二）基因組DNA提取及純度檢測(cè)

血液中基因組DNA提取采用酚/仿法進(jìn)行提取，用Pharmacia DNA/RNA濃度測(cè)定儀測(cè)定基因組DNA濃度和純度，OD260 nm與OD280 nm吸收比值在1.8～2.0范圍的DNA樣品純度較高。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，DNA電泳條帶為整齊、清晰的單一條帶。調(diào)整DNA終濃度至50 ng/μl，樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（三）序列擴(kuò)增和多態(tài)性分析

參考NCBI提交犬的GLT-1和GLAST基因的全序列，分別在其3'-UTR區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物（表5-1）。

PCR反應(yīng)體系均為：10×Buffer1μl，25mmol/LMgcl20.6μl，10mmol/LdNTP 0.6μl，10mmol/L引物各0.5μl，Taq酶0.5U，50ng/μl DNA模板1μl，ddH2O 6.3μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，退火 45s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10min，4℃保溫。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行回收克隆，并送北京三博公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果利用NCBI在線比對(duì)軟件Blast進(jìn)行比對(duì)尋找突變位點(diǎn)。

（四）行為測(cè)試

測(cè)試地點(diǎn)在公安部南昌警犬基地，測(cè)試時(shí)間為2005年9～11月。根據(jù)Miller (1985)、Hart (1985) 和Bradshaw (1996)等的測(cè)試程序 （Hart B L & Hart L A，1985；Hart & Miller，1985；Bradshaw et al，1996），根據(jù)南昌警犬基地的實(shí)際情況，適當(dāng)做了一些可行合理的修改。把每個(gè)行為性狀均分成4個(gè)等級(jí)，共定義了48個(gè)行為變量。根據(jù)在犬行為測(cè)試過(guò)程中，犬的具體行為表現(xiàn)給予評(píng)分。

（五）統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SAS的GLM過(guò)程構(gòu)建一般線性模型計(jì)算不同基因型的行為參數(shù)的最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較。構(gòu)建模型如下：

表5-1 用于擴(kuò)增基因組序列及PCR-RFLP的引物

yijklm=μ+Gh+Bi+Sj+Ak+eijklm

yijkl為性狀觀察值

μ為分析性狀的群體均值

Gh為三種基因型

Bi為品種效應(yīng)，固定效應(yīng)

Gj為性別效應(yīng)，固定效應(yīng)

Ak為年齡效應(yīng)，固定效應(yīng)

eijklm為隨機(jī)殘差效應(yīng)

建立單標(biāo)記回歸統(tǒng)計(jì)模型，計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)。性狀觀察值＝群體平均值＋基因加性效應(yīng)＋基因顯性效應(yīng)＋品種效應(yīng)＋性別效應(yīng)＋隨機(jī)殘差效應(yīng)。加性效應(yīng)用-1、0和1分別代表AA、AB和BB基因型；顯性效應(yīng)用1、-1和1分別代表AA、AB和BB基因型。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）序列比對(duì)

對(duì)擴(kuò)增的所有序列瓊脂糖檢測(cè)以后，回收、克隆和測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果利用NCBI在線比對(duì)軟件Blast進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果在GLT-1基因3'-UTR區(qū)域的第2170位發(fā)現(xiàn)了一個(gè)T/C突變，第2227位發(fā)現(xiàn)了一個(gè)A/T突變（見(jiàn)圖5-1）；在GLAST基因3'-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)突變位點(diǎn)：第2648位點(diǎn)的T/A突變和第2652位點(diǎn)的G/A突變（見(jiàn)圖5-2），在GLAST內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)突變位點(diǎn)（見(jiàn)圖5-3）。

（二）基因分型

1. GLT-1 （T2170C）位點(diǎn)的基因分型

由于該突變沒(méi)有引起酶切位點(diǎn)的改變，利用dCAPS Finder 2.0 program引入BsiYI酶切位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型。根據(jù)GLT-1（T2170C）引入引物進(jìn)行序列擴(kuò)增以后，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)為128bp，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，特異性好。經(jīng)BsiYI酶切以后：TT基因型為：128bp，一條帶；TC基因型為：128bp，111bp，17bp，三條帶；CC基因型為：111bp，17bp。但是由于17bp在電泳圖沒(méi)有顯出。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（見(jiàn)圖5-4）。

2. GLAST （T2648A）位點(diǎn)的基因分型

由于該突變沒(méi)有引起酶切位點(diǎn)的改變，同樣利用dCAPS Finder 2.0 program引入SspI酶切位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型。根據(jù)GLAST（T2648A）引入引物進(jìn)行序列擴(kuò)增以后，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)為157bp，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，特異性好。經(jīng)BsiYI酶切以后：TT基因型為：157bp，一條帶；AT基因型為：157bp，133bp，24bp，三條帶；AA基因型為：133bp, 24bp。但是由于24bp在電泳圖沒(méi)有顯出。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（見(jiàn)圖5-5）。

3. GLAST （G2652A）位點(diǎn)的基因分型

由于該突變沒(méi)有引起酶切位點(diǎn)的改變，利用dCAPS Finder 2.0 program 引入BsiYI酶切位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型。根據(jù)GLAST（T2648A）引入引物進(jìn)行序列擴(kuò)增以后，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)為498bp，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，特異性好。由于該片段本身有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，經(jīng)BsiYI酶切以后: AA基因型為：249bp, 128 bp，121bp三條帶；GA基因型為：249bp，224 bp, 128bp，121bp，25bp, 五條帶；GG基因型為：224 bp, 128bp，121bp，25bp, 四條帶。但是由于25bp在電泳圖沒(méi)有顯出。2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖5-6）。

（三）三個(gè)基因位點(diǎn)在兩犬品種基因型和基因型頻率分布

由表5-2可知：GLT-1(T2270C) 位點(diǎn)在德國(guó)牧羊犬中不存在多態(tài)性，所有個(gè)體均為TT基因型，而羅維納犬中，該位點(diǎn)的T等位基因和C等位基因幾乎平衡，分別為：52.2%和47.8%；GLAST(T2648A) 位點(diǎn)在兩個(gè)品種中，T等位基因均占有優(yōu)勢(shì)地位，分別為72.5%和62.5%，且AA基因型個(gè)體在兩個(gè)品種均較少，分別為5%和3%；而GLAST(G2652A) 位點(diǎn)在兩個(gè)品種中，A等位基因均占有優(yōu)勢(shì)地位，分別為：81.7%和70.6%。

（四）三個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)犬行為性狀的影響

利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析以后，數(shù)據(jù)顯示：GLT-1(T2170C) 對(duì)犬的食欲反射強(qiáng)度、自由反射強(qiáng)度和興奮性強(qiáng)度影響顯著，其中TT基因型個(gè)體的食欲反射強(qiáng)度明顯高于CC基因型個(gè)體（p<0.05），TC基因型個(gè)體的自由反射強(qiáng)度明顯高于TT基因型個(gè)體（p<0.05），而TC基因型個(gè)體的興奮轉(zhuǎn)抑制速度要高于TT基因型個(gè)體；GLAST(T2648A) 多態(tài)位點(diǎn)對(duì)犬的外抑制強(qiáng)度及超限抑制強(qiáng)度影響顯著，AA基因型個(gè)體的外抑制強(qiáng)度明顯高于TT基因型個(gè)體（p<0.001），TT基因型個(gè)體的超限抑制強(qiáng)度高于AA基因型個(gè)體（p<0.05）；而GLAST (A2652G) 多態(tài)位點(diǎn)對(duì)犬的分化抑制強(qiáng)度影響顯著，其中AA基因型個(gè)體的分化抑制強(qiáng)度低于AG型個(gè)體和GG型個(gè)體。

三、分析與討論

細(xì)胞外液谷氨酸濃度過(guò)高，對(duì)腦有損傷作用（因改變血腦屏障通透性，從而導(dǎo)致腦組織損害）。如果谷氨酸代謝發(fā)生改變，勢(shì)必會(huì)造成中樞神經(jīng)激發(fā)興奮性中毒，所以在谷氨酸代謝過(guò)程中，起到重要作用的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族對(duì)于保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有其重要的作用。國(guó)外，有些研究小組已經(jīng)開(kāi)始利用直接測(cè)序方法，來(lái)分析谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族多態(tài)性和犬行為之間的聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)犬的兩個(gè)最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因：GLT-1和GLAST，利用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果在GLT-1基因3'-UTR區(qū)域的第2170位發(fā)現(xiàn)了一個(gè)T/C突變，第2227位發(fā)現(xiàn)了一個(gè)A/T突變；在GLAST基因3'-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)突變位點(diǎn)：第2648位點(diǎn)的T/A突變和第2652位點(diǎn)的G/A突變，在GLAST內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)突變位點(diǎn)在GLAST基因。

GLT-1(T2270C) 位點(diǎn)在德國(guó)牧羊犬中不存在多態(tài)性，所有個(gè)體均為TT基因型，這說(shuō)明C等位在德國(guó)牧羊犬這個(gè)品種上，在選擇育種的過(guò)程中具有較好的選擇壓力；利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析以后，數(shù)據(jù)顯示：TT基因型個(gè)體的食欲反射強(qiáng)度明顯高于CC基因型個(gè)體（p<0.05），TC基因型個(gè)體的自由反射強(qiáng)度明顯高于TT基因型個(gè)體（p<0.05），而TC基因型個(gè)體的興奮轉(zhuǎn)抑制速度要高于TT基因型個(gè)體，綜合說(shuō)明：T等位基因在犬行為個(gè)體中是一個(gè)相對(duì)有利的等位基因。

表5-2 三個(gè)基因位點(diǎn)在兩犬品種基因型分布、基因頻率及雜合度

表5-3 三個(gè)基因位點(diǎn)不同基因型犬的各種行為性狀最小二乘值及基因效應(yīng)

GLAST(T2648A) 位點(diǎn)在兩個(gè)品種中，T等位基因均占有優(yōu)勢(shì)地位，分別為72.5%和62.5%，且AA基因型個(gè)體在兩個(gè)品種均較少，分別為5%和3%；數(shù)據(jù)顯示：該多態(tài)位點(diǎn)對(duì)犬的外抑制強(qiáng)度及超限抑制強(qiáng)度影響顯著，AA基因型個(gè)體的外抑制強(qiáng)度明顯高于TT基因型個(gè)體（p<0.001），TT基因型個(gè)體的超限抑制強(qiáng)度高于AA基因型個(gè)體p<0.05），說(shuō)明該位點(diǎn)可能會(huì)影響犬的外抑制強(qiáng)度及超限抑制強(qiáng)度。

GLAST(G2652A) 位點(diǎn)在兩個(gè)品種中，A等位基因均占有優(yōu)勢(shì)地位，分別為：81.7%和70.6%，且AA基因型個(gè)體的分化抑制強(qiáng)度低于AG型個(gè)體和GG型個(gè)體，。

由于本實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均在基因的3－UTR，隨著對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入認(rèn)識(shí), 真核mRNA 3－UTR在基因表達(dá)調(diào)控中的作用日益受到關(guān)注. 現(xiàn)已闡明, 它不僅調(diào)控mRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性及降解速率, 控制其利用效率,協(xié)助辨認(rèn)特殊密碼子等, 而且還調(diào)控特定mRNA的翻譯時(shí)間、位點(diǎn)及產(chǎn)物。

（作者單位：徐黎、葉俊華、楊前勇、馬長(zhǎng)書(shū) 、付平峰，公安部南昌警犬基地，330100；李德貴、楊利國(guó)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，430070）

（編輯：李 冰）