李大勇，陳文娜，谷峰，馬賢德，王柏慶，袁明殿

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032）

疏肝活血方含藥血清對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞血管新生相關(guān)基因表達的影響△

李大勇1*，陳文娜2，谷峰2，馬賢德2，王柏慶2，袁明殿1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032）

目的觀察疏肝活血方含藥血清對大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞（EPCs）血管新生相關(guān)基因VEGF、HGF和HIF-1α表達的影響。方法：從大鼠骨髓中獲取單個核細胞，體外培養(yǎng)1周后，采用免疫熒光細胞化學(xué)和激光共聚焦顯微鏡鑒定，于培養(yǎng)體系中加入疏肝活血方及其拆方的含藥血清，培養(yǎng)24h，Real-Time PCR方法檢測EPCs中VEGF、HGF和HIF-1α的mRNA表達。結(jié)果貼壁細胞培養(yǎng)誘導(dǎo)后具有內(nèi)皮細胞的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特征，Real-Time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疏肝活血方含藥血清能明顯提高EPCs中VEGF、HGF、HIF-1α的mRNA表達量，與對照相比差異具有顯著意義（P＜0.01）。結(jié)論疏肝活血方能促進EPCs中血管新生相關(guān)基因VEGF、HGF和HIF-1α的表達，是該方促血管新生的機制之一。

內(nèi)皮祖細胞；疏肝活血方；血清藥理學(xué)

治療性血管新生（therapeutic angiogenesis）在缺血性疾病的治療中具有美好的前景，是使缺血部位的側(cè)支血流增加、微循環(huán)得以改善的主要機制。人體循環(huán)血液中存在內(nèi)皮祖細胞（EPCs），在缺血的刺激下，EPCs能夠被動員、遷移、黏附和分化成內(nèi)皮細胞，新生血管中25%的內(nèi)皮細胞由EPCs分化而來［1］，EPCs對于血管新生和維持內(nèi)皮功能完整具有重要作用。

臨床實踐發(fā)現(xiàn)，對于肢體缺血性疾病，疏肝法與活血法配伍應(yīng)用，可使氣機調(diào)暢，血脈通利，患者肢體的溫度、顏色、間歇性跛行以及破潰的創(chuàng)面均有一定程度的改善［2］，實驗研究證實疏肝活血方能有效促進血管新生及EPCs數(shù)量的增加、功能的改善，減少 EPCs的凋亡［3，4］。本研究擬進一步通過EPCs培養(yǎng)體系觀察在疏肝活血含藥血清刺激下，EPCs中血管新生相關(guān)基因VEGF、HGF和 HIF-1α表達的變化。

1 材料

1.1 動物

健康清潔級雄性Wistar大鼠16只，體重（200±20）g，購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SYXKDK）（遼）2003-0019。

1.2 藥物

疏肝活血方（柴胡20g、香附20g、當(dāng)歸15g、赤芍15g），疏肝方（柴胡20g、香附20g），活血方（當(dāng)歸15g、赤芍15g），分別按體表面積比率折算出大鼠的等效用藥劑量，計算出水煎劑的終濃度，中藥飲片柴胡 （Radix Bupleuri，批 號 090308）、香附（Rhizoma Cyperi，批 號 090310）、 當(dāng) 歸 （Radix Angelica，批號090411）、赤芍（Radix Paeoniae Rubra，批號090312）均購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，并經(jīng)該院中藥教研室王淑清教授鑒定。

1.3 試劑

胎牛血清（美國Hyclong公司），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（美國Biosource公司），堿性成纖維細胞生長因子（美國R＆D公司），纖維連接蛋白（新西蘭Cal Biochem公司），M199培養(yǎng)基（美國Gibco公司），Dil標記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-acLDL）和 Trizol（美國Invitrogen公司），F(xiàn)ITC標記荊豆凝集素Ⅰ（FITCUEA-I）（美國 Sigma公司），熒光定量 PCR試劑盒（大連寶生物公司），PCR引物（北京華大基因公司合成）。

1.4 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），低溫高速離心機（美國Biofuge公司），倒置生物顯微鏡、倒置熒光顯微成像系統(tǒng)和激光掃描共聚焦顯微鏡（德國LEICA公司），ABIPRISM 7500熒光實時定量PCR儀（美國PE公司）。

2 方法

2.1 中藥制劑

疏肝活血方、疏肝方、活血方藥物各加蒸餾水5倍，浸泡30min，加熱至沸騰，改小火保持微沸30min，濾過。藥渣再加水3倍，同法煎煮20min，濾過。合并兩次煎液，濃縮至預(yù)定容積，滅菌保存。疏肝活血方及其拆方疏肝方、活血方的終濃度分別為0.40g飲片·mL－1、0.23g飲片·mL－1、0.17g飲片·mL－1。

2.2 含藥血清制備及分組

將16只大鼠按隨機數(shù)字等分成4組：疏肝活血方組、疏肝方組、活血方組和生理鹽水對照組。每日給予相應(yīng)的中藥或生理鹽水3mL灌胃，連續(xù)7d，末次給藥后1h，麻醉并通過下腔靜脈采血，無菌分離出血清，56℃滅活30min，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，將每組大鼠的血清混合，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

體重200g的Wistar大鼠麻醉后，頭部以下浸泡于75%乙醇中約5min，無菌條件下分離出兩側(cè)股骨，用0.1mol·L－1PBS沖洗骨髓腔，按等體積比將骨髓沖洗液緩慢加在淋巴細胞分離液的上層，1 500r·min－1，離心10min。取中間的單個核細胞層，M199培養(yǎng)基配成的稀釋液調(diào)整細胞密度為1×108·cm－2，接種于纖維連結(jié)蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。次日棄去上層懸浮細胞，加入培養(yǎng)液（含 VEGF 50ng·mL－1，bFGF 10ng·mL－1，肝素10U·mL－1，青、鏈霉素各 100U·mL－1，胎牛血清20%），隔日更換半量培養(yǎng)液1次。

將培養(yǎng)1周的貼壁細胞消化后，置于無菌蓋玻片，95%冷乙醇固定，漂洗后滴加兔抗鼠CD31多抗（1∶200，Santacruz公司）和兔抗鼠Ⅷ因子多抗（1∶100，Santacruz公司），濕盒內(nèi) 4℃過夜。PBS振洗，加異硫氰酸標記的二抗50μL（FITC IgG，武漢博士德），濕盒內(nèi)37℃孵育1h，PBS洗滌后熒光顯微鏡觀察。Ⅷ因子、CD31均為骨髓源性EPCs表面抗原，表達陽性者提示為分化早期的內(nèi)皮細胞。由2名觀察者獨立對每塊蓋坡片上的染色陽性細胞進行記數(shù)，隨機計數(shù)10個非重疊視野（×200），計算陽性細胞表達率。

M199培養(yǎng)液調(diào)整培養(yǎng)至9d的貼壁細胞密度為5×108·L－1，加入激光掃描共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，與 Dil－acLDL（2.4ng·mL－1）37℃孵育 1h，棄去上清液，2%多聚甲醛固定10min，PBS浸洗，與FITC-UEA-Ⅰ（10μg·mL－1）37℃孵育 1h，棄去上清液，PBS浸洗后，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，Dil-acLDL和FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs［5］，隨機計數(shù)10個非重疊視野（×200），計算雙染色陽性細胞比例。

2.4 給藥方法

取2個96孔培養(yǎng)板，每板取中央60孔加細胞。將培養(yǎng)至9d的EPCs以0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞密度為5×105·mL－1，每孔加100μL細胞懸液，饑餓培養(yǎng)12h后，分別加入各組血清（將各組血清用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液配成10%的血清孵育液），培養(yǎng)24h。

2.5 EPCs中VEGF、HGF、HIF-1α的mRNA表達

采用實時PCR（Real-Time PCR）檢測方法，含藥血清作用終點，收集各組貼壁細胞，Trizol法提取總RNA，20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中經(jīng)特異性引物（見表1）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以1μL cDNA為模板，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，ABI7500 Real-Time PCR儀器中反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃30s，95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)，95℃ 15s，60℃1min。反應(yīng)結(jié)束后，由7 500 Real-Time PCR軟件自動記錄熒光曲線并分析計算出Ct值，檢測被測樣品RNA的完整性和可靠性，應(yīng)用ΔΔCt［（樣品Ct均值－內(nèi)參照Ct均值）－（對照樣品Ct均值－對照內(nèi)參照Ct均值）］方法進行相對定量，然后取2－ΔΔCt即代表被檢樣品初始mRNA的含量，大于2是高表達，小于0.5是低表達。

表1 Real-Time PCR引物序列

2.6 統(tǒng)計分析

采用SAS6.12統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示，組間差異性比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定

原代細胞培養(yǎng)24h后，部分細胞出現(xiàn)變形，隱約可見偽足；3d時可見細胞集落形成；7d時可見梭形細胞明顯增多，見圖1。M199實驗培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后，骨髓源性EPCs表面抗原Ⅷ因子、CD31陽性表達的細胞分別為（38.4±4.1）%、（35.1±4.5）%，見圖2；Dil-acLDL和 FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性細胞為（82.3±7.6）%，見圖3。

圖1 內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的培養(yǎng)（×200）

圖2 EPCsⅧ因子、CD31免疫熒光染色（FITC標記，×200）

圖3 培養(yǎng)的EPCs通過激光共聚焦顯微鏡鑒定（×200）

3.2 含藥血清對 EPCs中 VEGF、HGF、HIF-1α m RNA表達的影響

Real-Time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疏肝活血方能明顯提高EPCs中VEGF、HGF、HIF-1α的mRNA表達量，與對照相比，差異具有極顯著意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 各組EPCs中VEGF、HGF、HIF-1α的m RNA含量（2－ΔΔCt，±s）

表2 各組EPCs中VEGF、HGF、HIF-1α的m RNA含量（2－ΔΔCt，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01，△P＜0.05

組別 VEGF HGF HIF-1α對照組111疏肝方組 1.38±0.51 4.31±1.98* 0.21±0.04活血方組 6.42±2.16*1.87±0.93 2.10±0.06△疏肝活血方組 10.91±3.77*11.74±3.62* 7.14±2.59*

4 討論

內(nèi)皮細胞是最接近于血流的一層細胞，釋放出的蛋白質(zhì)很容易通過血流擴散到全身從而廣泛發(fā)揮作用。來源于骨髓的EPCs是內(nèi)皮細胞的前體，具有旺盛的增殖能力，具有定向移植于血管生成部位的特點，能夠直接分化為血管內(nèi)皮細胞，在缺血等因素的刺激下，能夠動員入血，對缺血組織的修復(fù)起著重要作用；能有效調(diào)控EPCs功能的因素，有可能具有明顯的促血管新生作用。本研究成功建立了EPCs培養(yǎng)體系，并通過血清藥理學(xué)的方法進一步觀察了疏肝活血含藥血清對EPCs中血管新生相關(guān)基因VEGF、HGF和HIF-1α表達的變化。

中醫(yī)的 “肝”是一個范圍廣泛的功能活動系統(tǒng)，亦被稱為 “造化之始、生命之源?！庇袑W(xué)者通過 “從肝治心”立法，運用治肝為主的方藥能明顯促進缺血心肌新生血管的形成［6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)亦證實，柴胡、香附等多數(shù)疏肝藥物和復(fù)方對心血管系統(tǒng)均有改善作用。本研究發(fā)現(xiàn)，疏肝法與活血法相配伍，能夠明顯上調(diào)EPCs中血管新生相關(guān)基因VEGF、HGF和HIF-1α的表達，其效用明顯強于疏肝法和活血法的單獨應(yīng)用。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強效的促血管生成因子和調(diào)控干細胞向內(nèi)皮分化的重要細胞因子，能促血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，維持血管功能。缺血缺氧的刺激可誘導(dǎo)VEGF的基因表達，促進血管新生和對缺血組織的保護作用［7］，但內(nèi)源性VEGF表達的絕對量往往不足以完全代償缺血缺氧的狀態(tài)。因此，補充外源性VEGF基因，將會進一步促進血管生成，迅速改善缺血狀態(tài)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，EPCs在疏肝活血方含藥血清刺激下，VEGF的基因表達明顯增強，其效應(yīng)強于活血方和疏肝方，提示VEGF基因可能是本方的一個重要作用靶點。

HIF-1α是缺血缺氧發(fā)生與VEGF基因表達增強之間的一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［9］。缺氧促使HIF-1α過表達，并直接調(diào)控VEGF中的缺氧反應(yīng)元件（HRE），在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VEGF基因的表達。更深入的研究表明，在缺血缺氧后數(shù)小時內(nèi)局部組織中即可出現(xiàn) HIF-1αmRNA表達上調(diào)，明顯早于VEGF的mRNA表達［10］；當(dāng)局部應(yīng)用反義HIF-1α寡核苷酸時，VEGF的表達亦被阻斷［11］，將HIF-1α的干擾質(zhì)粒注入裸鼠的缺血肢體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血肢體血流減少，皮溫降低，毛細血管數(shù)量受到抑制［12］，均提示了組織缺血缺氧誘導(dǎo)HIF-1α在缺血組織中過表達，是血管新生的始動因素之一，是機體對抗缺血缺氧的一種自我保護機制。本研究發(fā)現(xiàn)，在疏肝活血方含藥血清的刺激下，明顯增強了EPCs中內(nèi)源性HIF-1α基因的表達量，這種效應(yīng)可能進一步啟動一系列的基因轉(zhuǎn)錄，包括紅細胞生成素、VEGF等，然后通過這些基因的產(chǎn)物，充分發(fā)揮其抗缺氧、促進血管新生的作用。

HGF也是近年來被深入研究的功能強大的血管生成因子，既可通過促進血管內(nèi)皮細胞分裂增殖、遷移趨化及形成管腔樣結(jié)構(gòu)而直接促進血管新生，又可通過誘導(dǎo)VEGF的mRNA表達間接促進血管生成，還可通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗內(nèi)皮細胞凋亡的作用。目前，攜帶HGF質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移至缺血組織，促進局部新血管生成的研究已進入臨床試驗，并可能成為治療周圍動脈閉塞性疾病的一種新手段［13］。本研究中，在疏肝或疏肝活血方含藥血清的作用下，明顯增強了EPCs中HGF的基因表達，提示疏肝理氣方藥有可能通過調(diào)控局部組織HGF基因的表達，增強EPCs的增殖、遷移及血管新生能力，改善EPCs的生物學(xué)功能。

同期進行的動物實驗發(fā)現(xiàn)，給予肢體缺血裸鼠灌胃疏肝活血方后，肢體的缺血程度得以改善，血管新生效應(yīng)明顯增強（將另成文發(fā)表）。本研究結(jié)果提示了促進EPCs中血管新生相關(guān)基因VEGF、HIF-1α和HGF的表達是疏肝活血方促血管新生作用的機制之一。

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Li Dayong1，Chen Wenna2，Gu Feng2，Ma Xiande2，Wang Baiqing2，Yuan Mingdian1

（1.Department of Vascular Surgery，the First Affiliated Hospital of Liaoning Traditional Chinese Medical University，Shenyang Liaoning 110032，China；2.Liaoning Traditional Chinese Medical University，Shenyang Liaoning 110032，China）

Effects of Shugan Huoxue Recipe Serum on Expression of Angiogenesis Related Genes in EPCs Derived from Rat Bone M arrow

Objective：To investigate the effects of Shugan Huoxue recipe serum on expressions

of angiogenesis related genes of endothelial progenitor cells（EPCs）derived from rat bonemarrow，includingvascular endothelial growth factor（VEGF），hepatocyte growth factor（HGF）and hypoxia inducible factor 1α（HIF-1α）.M ethods：The attached mononuclear cells isolated from rat bone marrow were assessed by immunofluorescence cytochemistry and laser scanning confocalmicroscope after 1 week culture.The application of real-time polymerase chain reaction（Real-Time PCR）detection was used to observe themRNA expression of VEGF，HGF and HIF-1αin EPCs，which were stimulated with the drug serum of Shugan Huoxue recipe and its separated recipe for 24h.Results：After cultured and induced by the drug serum，the cells represented the morphology and immunology characteristics identicalwith the endothelial cells.The drug serum of Shugan Huoxue recipe could increase themRNA expressions of VEGF，HGF and HIF-1αin EPCs，and the difference was obviously significant compared with control group（P＜0.01）.Conclusion：Shugan Huoxue recipe could increase the expressions of angiogenesis related genes in EPCs（VEGF，HGF and HIF-1α），and this pathway was one of themechanisms on promoting angiogenesis.

Endothelial progenitor cells；Shugan Huoxue recipe；Serum pharmacology

國家自然科學(xué)基金項目（30600843），“十一五”國家科技支撐計劃項目（2008BAI53B012），遼寧省科技廳博士啟動基金項目（20061030）

*李大勇，Tel：（024）86291229，E-mail：sylidy＠yahoo.com.cn