楊旭東，張杰，楊驕霞

（1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011）

白毛藤對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響△

楊旭東1*，張杰1，楊驕霞2

（1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011）

目的：探討B(tài)cl-xl、p53基因在白毛藤誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用。方法：不同濃度白毛藤作用于MCF-7細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡觀察人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR法檢測Bcl-xl、p53基因表達(dá)量的變化。結(jié)果：白毛藤能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，并且上調(diào)p53和降低Bcl-xl表達(dá)。結(jié)論：白毛藤抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與激活p53、抑制Bcl-xl表達(dá)有關(guān)。

白毛藤；乳腺癌；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是全球第二高發(fā)的惡性腫瘤，為女性發(fā)病率最高的癌癥。我國近年來乳腺癌發(fā)病率也呈現(xiàn)快速上升趨勢。目前臨床上治療手段是以手術(shù)和化療為主?；熢谌橄侔┲委熤姓加泻苤匾牡匚?，但仍存在一定的不良反應(yīng)和多藥耐藥性。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，中藥已經(jīng)成為當(dāng)今治療腫瘤的重要手段，其優(yōu)勢在于中藥不僅對腫瘤具有抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對機(jī)體的損傷和副作用也較小，因而研究中藥抗腫瘤作用及其分子機(jī)制是我國科學(xué)工作者的重要課題之一。白毛藤Solamum lyratumThunb系茄科植物白英的全草，具有清熱利濕、消腫解毒的功效［1］。白毛藤作為抗癌中藥之一，臨床上用于胃癌、肝癌等多種腫瘤的治療，已有研究表明，白毛藤水提物體外有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性［2］，但對其抗癌作用機(jī)理闡述并不明確。本研究的目的在于觀察白毛藤誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡作用，初步探討其作用機(jī)制，為白毛藤應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療提供一些新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞細(xì)胞株（武漢中美科技有限公司）。

1.2 藥物、試劑與儀器

白毛藤全草（購自牡丹江保健大藥房），經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與藥物研究中心袁曉環(huán)教授鑒定；MTT試劑（泰倫生物科技有限公司，批號041025）；Trizol（Sigma公司，批號15596-018）；引物核苷酸片段（上海生工生物技術(shù)有限公司）。熒光顯微鏡（CKX41-F32FL，奧林巴斯）。

1.3 藥物處理

白毛藤全草干品20g，粉碎，用400mL雙蒸水浸泡30min，加熱沸騰60min，倒出液體留用，藥渣加200mL雙蒸水再煮1次，合并兩次煮出液，使其自然冷卻，100目篩絹過濾，棄藥渣。濾液經(jīng)15 000 r·min－1，4℃離心20min，上清液用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，將干燥物溶解于40mL PBS，0.22μm除菌濾器過濾除菌，得0.5g·mL－1的棕褐色澄清透明溶液，避光冷藏，實(shí)驗(yàn)時(shí)再稀釋為所需要的藥物終濃度。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM中采用開放式單層貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，待細(xì)胞生長至80%濃度時(shí)，0.25%胰酶消化，每3d更換1次培養(yǎng)液。加受試物前7d將細(xì)胞用PBS洗滌后改為含10%去雌激素胎牛血清的無酚紅DMEM中培養(yǎng)，以耗盡細(xì)胞內(nèi)儲存的雌激素。實(shí)驗(yàn)組：用培養(yǎng)液倍比稀釋的濃度為4，6，8，16mg·mL－1的白毛藤水提液。對照組：用含MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測

取指數(shù)生長期的癌細(xì)胞，加入適量0.25%胰蛋白酶液消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制備成濃度為3×105·mL－1的細(xì)胞懸液，于6孔板中每孔接種1mL。將普通潔凈蓋玻片置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。24h后加入不同濃度的白毛藤；對照組加相同體積的培養(yǎng)液。48h后細(xì)胞用胰酶消化，冷PBS（pH7.2）洗3遍，固定液甲醇-冰醋酸（3∶1），4℃固定10min，棄固定液，蒸餾水洗3遍，室溫干燥，用5mg·L－1Hoechst33258染色，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育15min，將孔中的蓋玻片取出，蓋在已滴好甘油的載玻片上，置于熒光顯微鏡上觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.3 DNA裂解片段分析（DNA ladder）

取指數(shù)生長期癌細(xì)胞3×105個(gè)，加入不同濃度的白毛藤，作用72h后，收集細(xì)胞、洗滌，加裂解液50μL，50℃水浴1h；加RNA酶A（10g·L－1）10μL，50℃水浴2h；加2mol·L－1NaCl 60μL，震蕩后10 000r·min－1離心5min；取上清置于新的Eppendorf管中，加2.5倍體積的95%乙醇于－20℃沉淀過夜；次日10 000r·min－1離心10min，去上清液，室溫晾干，加TE液10μL溶解；2%瓊脂糖凝膠40 V電泳，凝膠掃描成像系統(tǒng)鑒定并照相。

2.4 RT-PCR測定Bcl-xl、p53表達(dá)

提取腫瘤細(xì)胞總RNA，用RT-PCR方法檢測腫瘤細(xì)胞Bcl-xl、p53基因表達(dá)。設(shè)計(jì)引物如下：bcl-xl引物，上游：5′-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3′；下游：5′-GCGATCCGACTCACCAATAC-3′，擴(kuò)增片段448bp。p53引物，上游：5′-TTCTCTCCCCAACAATGAGG-3′；下游：5′-TCTGTGAAGCAGCACCATTC23′，擴(kuò)增片段531bp。β-actin上游引物：5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，擴(kuò)增片段838bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；變性30s（94℃），退火30s（58℃），延伸1min（72℃），共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，分別計(jì)算bcl-xl、p53與內(nèi)參擴(kuò)增帶熒光強(qiáng)度×面積的比值，得出bcl-xl、p53 mRNA的相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡情況

熒光顯微鏡觀察不同濃度白毛藤作用48h后，可見藍(lán)色深染的凋亡細(xì)胞，并可見細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞體積縮小。實(shí)驗(yàn)組與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率（±s）

表1 各組細(xì)胞凋亡率（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

對照組3.41±2.12實(shí)驗(yàn)組2 14.64±5.62*4 16.17±8.04**8 20.54±9.02**16 23.42±9.89**

3.2 各組DNA ladder結(jié)果

對照組細(xì)胞DNA沒有片段化，而2，4mg·mL－1白毛藤組細(xì)胞72h基因組DNA開始降解，出現(xiàn)模糊的梯狀條帶，8，16mg·mL－1白毛藤組72 h后基本形成典型的梯狀條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 各組細(xì)胞DNA ladder情況

3.3 各組Bc1-xl和p53基因表達(dá)情況

與對照組相比，不同濃度白毛藤作用48h后，腫瘤細(xì)胞中原癌基因bcl-xl基因表達(dá)逐漸降低，抑癌基因p53基因表達(dá)逐漸增加，16mg·mL－1組最明顯，見圖2～3、表2。

圖2 各組細(xì)胞bcl-xl基因表達(dá)

圖3 各組細(xì)胞p53基因表達(dá)

表2 各組Bc1-xl和p53表達(dá)情況（±s）

表2 各組Bc1-xl和p53表達(dá)情況（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

-Actin對照組組別劑量／mg·mL－1 Bcl-xl／β-Actin p53／β 0.91±0.05 0.23±0.01實(shí)驗(yàn)組2 0.68±0.05*0.31±0.02*4 0.59±0.04**0.43±0.04**8 0.36±0.02**0.64±0.05**16 0.21±0.01**0.75±0.06**

4 討論

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡（Programed cell death，PCD），是在精密調(diào)節(jié)下的細(xì)胞的主動(dòng)死亡過程，在個(gè)體發(fā)育生長過程中起重要作用。細(xì)胞凋亡的異常與多種病理生理過程相關(guān)，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡調(diào)控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如bax、bak、bcl-xs等［3］。bcl-xl過表達(dá)與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，并能抑制化療等引起的凋亡，而下調(diào)其表達(dá)則能促進(jìn)凋亡發(fā)生［4］。p53基因?yàn)橐职┗?，存在于正常?xì)胞核中，對細(xì)胞損傷分化有抑制作用，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［5］。p53編碼多功能的抑癌蛋白p53，主要功能是在檢測基因組損傷、啟動(dòng)修復(fù)損傷基因組從而維持基因組穩(wěn)定，在抑制或阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)基因組損傷的細(xì)胞凋亡等方面起到?jīng)Q定性作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生、去除衰老細(xì)胞等［6］。

本研究結(jié)果顯示，白毛藤促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，濃度越大，作用越明顯。白毛藤可以明顯上調(diào)乳腺癌細(xì)胞p53基因mRNA表達(dá)，降低bcl-xl基因mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，白毛藤誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-xl和p53基因表達(dá)有關(guān)。

［1］馮洪錢.民間獸醫(yī)本草［M］.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1993：307-308.

［2］施文榮，劉艷.白英對人急性早幼粒白血病HL60細(xì)胞生長的影響［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，12（1）：36-38.

［3］Nicholson DW，Thomberry NA.Apoptosis：Life and death decision［J］.Science，2003，299：214-215.

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［5］Tordan J，Galmdo M F，Piehn JH，etal.P53 expression induces apoptosis in hippoocampal Pyramidal neuron cultures［J］.JNeurosci，1997，17：1397-1405.

［6］RILEY T，SONTAGE，CHEN P，etal.Transcriptional control of human p53-regulated genes［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（5）：402-412.

Effect of Solanum Lyratum Thunb on the Apoptosis of MCF-7 Human Breast Cancer Cells

Yang Xudong，Zhang jie，Yang Jiaoxia
（1.Mudanjiang Medical College，Mudanjiang Heilongjiang157011，China；2.HongQi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Mudanjiang Heilongjiang157011；China）

Objective：To investigate the effect of Bcl-xl and p53 gene on Human breast cancer MCF-7 cells.MethodsHuman breast cancer MCF-7 cellswere treated with various ofSolanum lyratumThunb，We observed cell apoptosis of MCF-7 cells by fluorescencemicroscope.We detected the levels of Bcl-xl and p53 gene expression in all groups by RT-PCR.ResultsSolanum lyratumThunb has obviously apoptosis-inducing effects on Human breast cancer MCF-7 cells and could effectively decrease the level of Bcl-xl gene expression and recrease the level of Bcl-xl gene expression.ConclusionSolanum lyratumThunb could induce apoptosis of MCF-7 cells probably by regulating Bcl-xl gene expression and regulating p53 gene expression.

Solanum lyratumThunb；Breast cancer；Apoptosis

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目——白毛藤有效成分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究（11531398）

*楊旭東，Email：xingzhe01mdj＠126.com

2009-11-23）