孫偉杰，王素艷，谷桂娜，劉春艷

（遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧大連116029）

介孔分子篩SBA-16固定化木瓜蛋白酶性質(zhì)的研究*

孫偉杰，王素艷，谷桂娜，劉春艷

（遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧大連116029）

以介孔分子篩SBA-16為載體采用物理吸附的方法對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行了固定化，研究了固定化條件對(duì)酶的相對(duì)活性的影響及在不同pH值下游離酶和固載酶的pH穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)1 g載體的給酶量為30 mg，固定化時(shí)間為2.5 h，pH值為7.0時(shí)，固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)活性最好。與游離酶相比，固定化酶的pH穩(wěn)定性有明顯改善。

SBA-16分子篩；固定化；木瓜蛋白酶；相對(duì)活性

木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，因其作用溫和、特異性強(qiáng)，在食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[1-2]。然而游離的木瓜蛋白酶pH穩(wěn)定性差，在溶液中易發(fā)生自解，因此使用效率很低。與游離酶相比，固定化酶具有很好的pH穩(wěn)定性，正逐步受到國(guó)內(nèi)外研究人士的重視。例如，北京化工大學(xué)的肖寧等[3]采用戊二醛作為交聯(lián)劑，MCM-41為載體固載木瓜蛋白酶；北京化工大學(xué)趙炳超等[4]以MCM-48為載體，戊二醛作交聯(lián)劑對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行了固定化研究等均已見(jiàn)報(bào)道。他們采用的固載方法為共價(jià)交聯(lián)法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體之間的連接很牢固，穩(wěn)定性好，但反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，得到的固定化酶的活性較低。物理吸附的方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，載體可反復(fù)使用[5]，有利于保持酶分子的結(jié)構(gòu)和性能，從而有效克服了交聯(lián)法對(duì)酶性能的干擾。這方面的研究在國(guó)外已經(jīng)開(kāi)始，例如，Diaz等[6]曾經(jīng)采用MCM-41作為載體，進(jìn)行了直接吸附木瓜蛋白酶的研究，并取得了一定效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SBA-16分子篩（實(shí)驗(yàn)室自制）、木瓜蛋白酶（Sigma公司）、酪蛋白（Sigma公司）、酪氨酸（Sigma公司）；鹽酸半胱氨酸、EDTA、三氯醋酸以及配制緩沖溶液（0.1 mol/L的鈉鹽）所用的磷酸鹽等，均為分析純。

1.2 固定化木瓜蛋白酶的制備

將1 g的SBA-16粉末和3 mL，pH為7.0的磷酸緩沖溶液加入25 mL的錐形瓶?jī)?nèi)，然后再加入5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液1 mL。固定化反應(yīng)在溫度為20℃，攪拌速度為180 r/min的條件下進(jìn)行2 h，過(guò)濾，洗滌，自然干燥，即得到固定化木瓜蛋白酶。

1.3 游離及固定化木瓜蛋白酶活性的測(cè)定[7]

木瓜蛋白酶的活性是以酪蛋白作底物、酪氨酸作標(biāo)準(zhǔn)物用紫外方法測(cè)量。具體操作如下：精密量取酪蛋白溶液3 mL，加入5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液1 mL和2 mL的激活劑，搖勻，置40℃水浴中，酶解20 min，加入3 mL三氯醋酸溶液終止酶解反應(yīng)，過(guò)濾，濾液稀釋20倍作供試液。上述條件，先加三氯醋酸，再加木瓜蛋白酶溶液置40℃水浴中放置20 min，過(guò)濾，濾液稀釋20倍作空白溶液。以0.1 mol/L鹽酸溶液作空白，酪氨酸為對(duì)照品，在275 nm波長(zhǎng)處測(cè)定空白溶液、供試液和對(duì)照品溶液的吸光度。

式中：A—供試液的吸光度減去空白溶液的吸光度；

As—酪氨酸對(duì)照品溶液的吸光度；

Cs—酪氨酸對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；

W—樣品質(zhì)量，mg。

相對(duì)活性指以同組實(shí)驗(yàn)中活性最大值為100%其它實(shí)驗(yàn)點(diǎn)值與該點(diǎn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 SBA-16分子篩和固定化木瓜蛋白酶的表征

圖1為SBA-16分子篩和固定化酶的XRD圖。

2種樣品的XRD圖均具有SBA-16分子篩典型的特征衍射峰，這與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的純硅SBA-16圖一致。從圖1可知固定化酶的XRD圖中2θ要比SBA-16分子篩的大，說(shuō)明酶進(jìn)入SBA-16分子篩的孔徑內(nèi)，使載體的孔徑變小，但并沒(méi)有破壞SBA-16分子篩的框架結(jié)構(gòu)。

2.2 固定化條件對(duì)固定化酶活性的影響

2.2.1 固定化時(shí)間的影響

采用不同的固定化時(shí)間，制得的固定化酶的相對(duì)活性見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，隨著固載時(shí)間的增加，固定化酶的相對(duì)活性先增加后降低，其原因可能是：（1）隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，進(jìn)入載體孔道內(nèi)的酶量增加，固定化酶的相對(duì)活性升高；（2）木瓜蛋白酶分子停留在載體孔口，使另一部分酶分子需要克服擴(kuò)散阻力才能進(jìn)入到載體的孔道內(nèi)部，并且已經(jīng)固定上的酶由于受到載體的影響可能變性失活[3]，使得固定化酶的相對(duì)活性開(kāi)始降低。因此，固定化木瓜蛋白酶的最佳攪拌時(shí)間為2.5 h。

2.2.2 給酶量的影響

體積一定，濃度不同的木瓜蛋白酶溶液，在相同的固定化時(shí)間2 h內(nèi)制得的固定化酶的相對(duì)活性見(jiàn)圖3。

由圖可知，當(dāng)1 g載體的給酶量達(dá)到30 mg時(shí)，固定化酶的相對(duì)活性最高，繼續(xù)增加給酶量，固定化酶的活性緩慢下降。在攪拌時(shí)間一定的條件下，隨著給酶濃度的增加，載體對(duì)木瓜蛋白酶的吸附逐漸達(dá)到最大吸附，固定化酶的相對(duì)活性也達(dá)到最大值。固載上的酶易脫落或發(fā)生變性而使固定化酶的相對(duì)活性緩慢下降。

2.2.3 pH對(duì)固定化的影響

用相同體積，不同pH值的磷酸緩沖溶液制得的固定化酶的相對(duì)活性見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，固載后的木瓜蛋白酶在pH值為7.0左右相對(duì)活性最大，原因可能是：酶在酸堿性的溶液中，極易失活，導(dǎo)致固定化酶的活性降低。

2.3 固定化酶的pH穩(wěn)定性

取等量游離木瓜蛋白酶及上述最佳條件下制得的固定化木瓜蛋白酶分別放在不同pH值的磷酸緩沖溶液中，靜置24 h。得出游離酶及固定化酶的相對(duì)活性如圖5所示。

從圖5可以看出，在pH 5.8～7.8的范圍內(nèi)，固定化酶的pH穩(wěn)定性范圍比游離酶更寬。因?yàn)镾BA-16表面富含羥基，這些羥基可以對(duì)分子篩孔道中溶液的pH值起一定的緩沖作用，從而使孔道內(nèi)溶液的pH變化范圍小于磷酸緩沖溶液的pH變化范圍，這很可能是固定化木瓜蛋白酶pH穩(wěn)定性提高的一個(gè)重要的原因[8]。

3 結(jié)論

本文采用物理吸附的方法，以SBA-16分子篩做載體固定化木瓜蛋白酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)1 g的 SBA-16分子篩載體在pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中，給酶量為30 mg，固定化時(shí)間為2.5 h時(shí)，固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)活性最好。與游離酶相比，固定化酶的pH穩(wěn)定性有明顯提高。因此，SBA-16分子篩可以作為一種固載木瓜蛋白酶新的載體。

[1]趙元藩，丁認(rèn)全.木瓜蛋白酶的加工工藝及應(yīng)[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，19（5）：15-17.

[2]乙引，陳平，王茜.木瓜蛋白酶改良啤酒品質(zhì)的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，28（4）：14-16.

[3]肖寧，趙炳超，王艷輝.介孔分子篩MCM-41固定化木瓜蛋白酶的研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，32（4）：41-43.

[4]趙炳超，馬潤(rùn)宇，石波.介孔分子篩MCM-48固定化木瓜蛋白酶性質(zhì)的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（10）：60-63.

[5]陳靜.介孔材料固定酶的性質(zhì)和穩(wěn)定性研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2005.

[6]Felipe J，Diaz，kenneth J，et al.Enzyme immobilized in MCM-41 molecular sieve[J].Journal of Molecular Catalysis B，Enzymatic，1996（2）：115-126.

[7]羅遠(yuǎn)秀.木瓜酶活力測(cè)定方法的研究[J].廣西藥品檢驗(yàn)所，2000，35（8）：556-558.

[8]趙麗芳.脂肪酶的固定化及其催化性能的研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2008.

Immobilization of Papain on Mesoporous Molecular Sieve SBA-16

SUN Wei-jie，WANG Su-yan，GU Gui-na，LIU Chun-yan

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Liaoning Normal University，Liaoning Dalian 116029，China）

Papain was immobilized on the mesoporous molecular sieve SBA-16 by physical adsorption method.The effects of immobilization conditions on the relative activity of the papain were studied.At the same time，the pH stability of the free enzyme and immobilized enzyme was discussed at different pH values.Experimental results show that the optimum conditions for immobilization are as follows:concentration of the free enzyme，time，and pH are 30 mg/g，2.5 h and 7.0，respectively.Compared with the free enzyme，pH-stability of immobilized papain has also been improved.

Molecular sieve SBA-16；Immobilized；Papain；Relative activity

TQ925+.2

A

1671-0460（2010）02-0129-03

2010-03-03

孫偉杰（1983-），女，碩士研究生。

劉春艷（1971-），女，副教授，研究方向?yàn)榻榭撞牧系闹苽渑c應(yīng)用。E-mail:lcybeauty@163.com。