劉曉芳 李學(xué)強(qiáng) 葉武龍 周彬彬 劉又年

(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,長(zhǎng)沙 410083)

二茂鐵-肽Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成及其與Cu(II)作用

劉曉芳 李學(xué)強(qiáng) 葉武龍 周彬彬 劉又年*

(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,長(zhǎng)沙 410083)

以二茂鐵甲酸、甘氨酸(H-Gly-OMe)、脯氨酸(Boc-Pro-OH)、精氨酸(H-Arg(NO2)-OMe)等為原料,苯并三唑-1-四甲基六磷酸酯(HBTU)和1-羥基苯并三唑(HOBT)為縮合劑,采用液相法合成了二茂鐵-肽Fc-Gly-Pro-Arg (NO2)-OMe(簡(jiǎn)稱Fc-GPR),其總收率為48.1%.并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了紅外(IR)光譜、核磁共振氫譜(1H-NMR)、質(zhì)譜(ESI-MS)等表征.通過(guò)電化學(xué)方法研究了目標(biāo)產(chǎn)物與Cu(II)之間的相互作用.結(jié)果表明:目標(biāo)產(chǎn)物在溶液中的電化學(xué)行為表現(xiàn)為可逆氧化還原反應(yīng),氧化和還原峰電位分別為0.624和0.552 V(vs Ag/AgCl),氧化和還原峰電流之比Ipa/Ipc為1.13,電極反應(yīng)過(guò)程為擴(kuò)散控制.目標(biāo)產(chǎn)物與Cu(II)形成配位比為2∶1的配合物.Fc-GPR與Cu(II)的電極反應(yīng)過(guò)程符合電化學(xué)-化學(xué)-電化學(xué)(ECE)歷程.

二茂鐵-肽;液相合成;Gly-Pro-Arg;電化學(xué)-化學(xué)-電化學(xué)歷程;銅離子

二茂鐵是一種具有一定厚度的夾心結(jié)構(gòu)和芳香性的富電子體系,熱穩(wěn)定性好,電化學(xué)氧化還原可逆且易受環(huán)境影響.目前二茂鐵衍生物的研究越來(lái)越引起科學(xué)家的興趣.它具有良好的親脂性,能順利通過(guò)細(xì)胞膜,從而與細(xì)胞內(nèi)的各種酶、DNA等物質(zhì)作用,它的低毒性、穩(wěn)定性使其廣泛應(yīng)用于藥物研究.例如在青霉素和先鋒霉素中引入二茂鐵基時(shí)可使抗菌活性提高[1].此外,二茂鐵衍生物及其配合物具有抗癌[2-3]、抗瘧疾[4]、抗炎等生物活性;二茂鐵還可標(biāo)記DNA和多肽[5-6]作為電化學(xué)探針,應(yīng)用于特定序列DNA片段和蛋白的識(shí)別和檢測(cè)等[7-8].

Gly-Pro-Arg(GPR)寡肽是一種能夠抑制由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,簡(jiǎn)稱Aβ)導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞毒性的活性肽[9],它能減少Aβ對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷;此外,Furlan等[10-11]發(fā)現(xiàn)GPR可以抑制纖維蛋白原的聚集,從而阻止纖維蛋白的形成.但是, GPR對(duì)Aβ的抑制機(jī)理尚不明確.生物電化學(xué)方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),但GPR不具有電化學(xué)活性,因此,可以將Fc-GPR作為電化學(xué)探針來(lái)研究GPR抑制阿爾默海次病(Alzheimer′s disease,簡(jiǎn)稱AD病)的治療機(jī)理.此外,引入疏水性二茂鐵基團(tuán),可以增加寡肽的穩(wěn)定性和脂溶性,使其能夠順利地透過(guò)血腦屏障而到達(dá)給藥靶點(diǎn).

銅是一些酶的重要組成部分,在人體大腦新陳代謝中起著重要的作用,銅離子參與了許多生化反應(yīng)過(guò)程,但是體內(nèi)過(guò)高的Cu(II)濃度能產(chǎn)生毒性[12],如改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),與某些氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生非特異的反應(yīng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊.有文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]銅積累可促進(jìn)阿爾默海次病患者腦中Aβ聚集而導(dǎo)致老年斑的形成:Aβ可以結(jié)合Cu(II),引起氧化損傷[15],導(dǎo)致細(xì)胞死亡,這可能是引發(fā)AD病的原因之一.此外,Freedman等[16-18]利用電子順磁共振(EPR)，單晶X射線衍射分析等方法研究了Cu(II)與短肽分子的配位應(yīng)用.如在中性條件下,三肽Gly-His-Lys(GHK)與Cu(II)形成1∶1的絡(luò)合物,該絡(luò)合物具有生物活性,可用于治療傷口和皮膚的損傷.

多肽分子與金屬離子配位作用的研究方法主要有:單晶X射線衍射分析、圓二色(CD)譜、EPR、 NMR、MS等.但是多肽作為配體與金屬離子的絡(luò)合物不易得到單晶,難以用單晶X射線衍射分析.另外,CD、EPR、NMR和MS等方法又存在操作繁瑣、儀器昂貴等不足,而電化學(xué)方法具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏的特點(diǎn).將具有電化學(xué)活性的二茂鐵基引入到多肽中,可以通過(guò)電化學(xué)方法研究多肽與金屬離子的配位和電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理.在本文中,采用液相合成法合成二茂鐵-肽Fc-GPR,利用電化學(xué)方法研究該化合物與Cu(II)作用,并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探討.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司),INOVA400核磁共振儀(美國(guó)Varian公司),LCQ Advantage離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)菲尼根公司).CHI440電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公).

H-Gly-OMe,Boc-Pro-OH,H-Arg(NO2)-OMe均為分析純且購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司;二茂鐵甲酸、苯并三唑-1-四甲基六磷酸酯(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)均為分析純,購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司;CuCl2·2H2O和四丁基高氯酸胺(TBAP)為色譜純,購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司;二氯甲烷經(jīng)氫化鈣干燥重蒸,甲醇為色譜純,其它試劑均為分析純,所有水均為二次蒸餾水.

1.2 目標(biāo)產(chǎn)物合成

[19-21]報(bào)道的合成二茂鐵-多肽方法合成目標(biāo)產(chǎn)物,以二茂鐵甲酸為原料,HBTU/ HOBT為縮合劑,采用液相合成的方法得到二茂鐵-三肽化合物:Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe.其合成路線如圖1所示.

圖1 Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe(Fc-GPR)的合成Fig.1 Synthesis of ferrocenoyl-labeled Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe(Fc-GPR)i)N-hydroxybenzotriazole(HOBT)/o-benzotriazol-1-yl-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HBTU),Et3N,CH2Cl2; ii)NaOH;iii)HCl,CH3COOCH2CH3

1.2.1 H-Pro-Arg(NO2)-OMe(2)的合成

稱取Boc-Pro-OH(4.0 mmol,0.86 g)溶于無(wú)水CH2Cl2,于0℃下緩慢滴入1.5 mL Et3N,并依次加入HBTU(4.4 mmol,1.52 g),HOBT(4.4 mmol,0.60 g),反應(yīng)1 h后,加入H-Arg(NO2)-OMe(4.0 mmol,1.08 g),0℃恒溫反應(yīng)1 h,移入室溫反應(yīng),用薄層色譜法(TLC)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程.待反應(yīng)完全,依次用10%鹽酸,飽和NaHCO3溶液和蒸餾水洗滌;有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉脫水,真空干燥即得粗產(chǎn)物1.59 g,產(chǎn)率為85%.

將化合物Boc-Pro-Arg(NO2)-OMe溶于無(wú)水乙酸乙酯,0℃下緩慢通入干燥的HCl氣體攪拌反應(yīng)1 h,移入室溫反應(yīng)1 h后,真空干燥,除去過(guò)量HCl氣體,得產(chǎn)物H-Pro-Arg(NO2)-OMe(2).

1.2.2 二茂鐵-甘氨酸及目標(biāo)產(chǎn)物(Fc-GPR)的合成

(1)化合物Fc-Gly-OH(4)的合成

稱取化合物3(5.65 mmol,1.3 g)溶于無(wú)水CH2Cl2,冰浴下攪拌緩慢滴加2.0 mL Et3N,再依次加入HBTU (6.19 mmol,2.4 g),HOBT(6.19 mmol,0.84 g),反應(yīng)1 h后,加入H-Gly-OMe(8.02 mmol,1.00 g),0℃恒溫反應(yīng)1 h;移入室溫反應(yīng),用TLC檢測(cè)反應(yīng).待反應(yīng)完全,依次用10%鹽酸,飽和NaHCO3溶液,蒸餾水洗滌;有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥,過(guò)濾,真空干燥,柱層析法純化[展開(kāi)劑V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)= 2∶1],即可得化合物Fc-GlyOMe 1.56 g.

將1.56 g Fc-GlyOMe溶于50 mL四氫呋喃,用少量的蒸餾水溶解0.18 g NaOH,加入反應(yīng)液中冰浴下反應(yīng)0.5 h,移入室溫下反應(yīng)12 h;反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液蒸干,加水50 mL,用乙酸乙酯洗三次,取水相用體積比為1∶1的HCl調(diào)節(jié)pH為1-2,再用乙酸乙酯洗三次,取油相,無(wú)水硫酸鈉干燥,抽濾蒸干后即得產(chǎn)物(4)1.04 g,產(chǎn)率為78%.

(2)Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成

稱取二茂鐵-甘氨酸(3.614 mmol,1.04 g)溶于無(wú)水CH2Cl2,0℃下緩慢滴入1.5 mL Et3N,依次加入HBTU(3.975 mmol,1.51 g),HOBT(3.975 mmol,0.54 g),反應(yīng)1 h后,加入化合物4(3.4 mmol,1.45 g),0℃恒溫反應(yīng)1 h,移入室溫反應(yīng),用TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程.待反應(yīng)完全,依次用10%鹽酸、飽和NaHCO3溶液、蒸餾水洗滌,有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥,過(guò)濾,真空干燥即可得粗產(chǎn)物1.73 g.用柱層析法[展開(kāi)劑的體積比為V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)∶V(CH3OH)=90∶30∶5,Rf=0.37]進(jìn)行純化,真空干燥,得到產(chǎn)物1.60 g.總收率為48.1%.IR(cm-1):1105,824 cm-1(ν(Fc)); 1740 cm-1(ν(C═O));3307 cm-1(ν(N—H));1438 cm-1(ν(C—N));1539 cm-1(δ(N—H));1629 cm-1(ν(C═N Arg)).1H-NMR(CDCl3,δ):8.206(s,H,HNCO,Arg), 7.38(s,H,H—N,Gly),7.021(s,H,NHC═NH,Arg), 4.627(quint,H,CH,Arg),4.398(s,2H,H-2′,H-5′,Fc), 4.351(s,2H,H-3′,H-4′,Fc),4.215(s,2H,Gly),3.792 (s,3H,OCH3,Arg),3.241(s,5H,Fcunsubst).ESI-MS,m/z: 622.6[M+Na]+.

1.2.3 Boc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成

稱取Boc-Gly-OH(4.0 mmol,0.69 g)溶于無(wú)水CH2Cl2.0℃下緩慢滴入1.5 mL Et3N,依次加入HBTU (4.4 mmol,1.52 g),HOBT(4.4 mmol,0.6 g),反應(yīng)1 h后,加入化合物2(3.0 mmol,1.40 g),0℃恒溫反應(yīng)1 h,移入室溫反應(yīng),用TLC檢測(cè)反應(yīng) [展開(kāi)劑體積之比V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)∶V(CH3OH)=90∶30∶3],待反應(yīng)完全.依次用10%鹽酸、飽和NaHCO3溶液、蒸餾水洗滌,有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥,過(guò)濾,真空干燥即可得粗產(chǎn)物1.73 g.用柱層析法對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化,展開(kāi)劑體積之比為V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)∶V(CH3OH)=90∶30∶5,Rf=0.42.真空干燥,得到產(chǎn)物(GPR)1.60 g.總收率為56.1%(對(duì)Boc-Gly-OH).FT-IR(KBr,cm-1):742 cm-1(ν(C═O,—COOCH3));3309 cm-1(ν(N—H));1453 cm-1(ν(C—N));1537 cm-1(δ(N—H));1644 cm-1(ν(C═N)),1255 (ν(NO2)).1H-NMR(CDCl3,δ):8.420(s,1H,HNCO, Arg),7.762(s,H—N,Gly),7.211,6.13(s,1H,NHC═NH,Arg),7.271(s,1H,CDCl3),4.625(sxt,2H,CH, Arg),3.76 7(s,3H,OCH3,Arg),3.357,3.251(s,2H, CH2,Pro),3.523,3.492 (s,2H,CH2,Gly),1.435(s, 9H,Boc).

1.2.4 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

將配好的4 mmol·L-1的Fc-GPR溶液中移取0.75 mL加入10 mL的培養(yǎng)皿中,再用移液管移取不同配比的CuCl2的甲醇溶液,搖勻反應(yīng)過(guò)夜.12 h后用移液管加入0.3 mL配好的1 mol·L-1的TBAP溶液作為支持電解質(zhì),再加入一定量的甲醇,使得測(cè)量體系的溶劑的總體積為6 mL,輕微晃動(dòng)至均勻,避光靜置過(guò)夜,室溫下進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試,以玻碳電極為工作電極,Ag/AgCl電極為參比電極,鉑絲(Pt)電極為對(duì)電極,支持電解質(zhì)為0.05 mol·L-1的TBAP,掃描速率為100 mV·s-1,每次測(cè)定前電解池通入10 min氮?dú)獬?

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的表征

二茂鐵基團(tuán)上的質(zhì)子化學(xué)位移一般在4-5之間,目標(biāo)化合物在化學(xué)位移4.351-4.40之間出現(xiàn)被取代的環(huán)戊二烯環(huán)上的4個(gè)質(zhì)子峰,3.24出現(xiàn)另外一個(gè)茂環(huán)上的5個(gè)質(zhì)子峰.4.627可指認(rèn)為精氨酸次甲基上的1個(gè)質(zhì)子峰,化學(xué)位移為7.02的峰可指認(rèn)為精氨酸胍基上的質(zhì)子峰,胍基上的另外兩個(gè)質(zhì)子峰未能觀察到,可能是胍基上的兩個(gè)質(zhì)子與硝基形成六元環(huán)的分子內(nèi)氫鍵,而化學(xué)位移7.38的單峰可指認(rèn)為二茂鐵甲酸與甘氨酸所結(jié)合酰氨鍵上氨基的質(zhì)子峰,化學(xué)位移為8.21的單峰可指認(rèn)為精氨酸酰胺鍵上的1個(gè)質(zhì)子峰.亞甲基的化學(xué)位移一般在2-4之間出現(xiàn).

2.2 電化學(xué)性質(zhì)

通過(guò)循環(huán)伏安(CV)方法對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物Fc-GPR進(jìn)行電化學(xué)性能測(cè)試,結(jié)果如圖2所示.當(dāng)掃描速率為100 mV·s-1時(shí),在0.4-0.8 V范圍內(nèi)出現(xiàn)了一對(duì)可逆性較好的氧化還原峰,氧化峰和還原峰電位分別為0.624和0.552 V,峰電位差為△Ep=72 mV,峰電流之比ipa/ipc=1.13,表明Fc-GPR在溶液中的良好的電子傳遞能力.當(dāng)改變掃描速率,發(fā)現(xiàn)其峰電流隨掃描速率的增加而增加,且峰電流和掃描速率的平方根成正比例關(guān)系,說(shuō)明該電極反應(yīng)步驟受擴(kuò)散控制.

2.3 目標(biāo)產(chǎn)物與銅離子絡(luò)合的電化學(xué)性質(zhì)

根據(jù)經(jīng)典的測(cè)定絡(luò)合物配比的摩爾比列法[22],即通過(guò)固定溶液中Fc-GPR的濃度,改變Cu(II)的濃度,根據(jù)二茂鐵陽(yáng)極峰電流發(fā)生改變的情況計(jì)算出Cu(II)與Fc-GPR的配位比.如圖3所示,曲線轉(zhuǎn)折點(diǎn)m對(duì)應(yīng)的摩爾濃度比c(FcGPR)/c(Cu2+)=2∶1,即 Fc-GPR與Cu(II)形成配合物[Cu(Fc-GPR)2]Cl2.

圖2 Fc-GPR的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammogram of Fc-GPRscan rate:100 mV·s-1

由圖4可知:當(dāng)c(Fc-GPR)/c(Cu2+)=1∶2時(shí),電對(duì)Cu(II)/Cu(I)的峰電位差隨著掃描速率的增加而增大,表明Cu(I)離子在配位環(huán)境中比游離的Cu(I)能夠更穩(wěn)定地存在,主要是因?yàn)镃u(I)離子在配位環(huán)境中的電化學(xué)過(guò)程發(fā)生了重排,則相對(duì)較高的還原電位表明Cu(I)在FcGPR的配位作用下更穩(wěn)定[23].

圖5 0.5 mmol·L-1Fc-GPR與0.5 mmol·L-1Cu2+溶液的循環(huán)伏安(CV)圖Fig.5 Cyclic voltammogram of Fc-GPR (0.5 mmol·L-1)with Cu2+(0.5 mmol·L-1)

2.4 ECE偶合反應(yīng)機(jī)理

如圖5所示目標(biāo)產(chǎn)物(Fc-GPR)與Cu(II)的作用是一個(gè)單電子兩步反應(yīng),根據(jù)ECE[24-27]反應(yīng)機(jī)理,其電化學(xué)過(guò)程[28-30]為:

圖6 不同濃度GPR與Cu(II)作用的微分脈沖伏安圖Fig.6 Differential pulse voltammogram on carbon electrode of Cu(II)with GPRc(Cu2+)=0.5 mmol·L-1;c(GPR)/(mmol·L-1):a)0,b)0.5,c)1.0

對(duì)于兩步單電子反應(yīng),△E比-(RT/nF)ln2=-35.6 mV正時(shí),表示正相互作用(即第二步電子轉(zhuǎn)移受到第一步反應(yīng)的促進(jìn));△E比-(RT/nF)ln2=-35.6 mV負(fù)時(shí),表示負(fù)相互作用.當(dāng)c(Fc-GPR/c(Cu2+)=1∶1時(shí),△E=E2-E1=0.3395 V-0.5885 V=-249 mV＜-35.6 mV,可以明顯觀察到此時(shí)CV圖有兩個(gè)波形[29-30].因此,當(dāng)Fc-GPR的量不變,加入的銅離子的量增加時(shí),溶液中游離的Fc-GPR的量減少,使得反應(yīng)(1)難發(fā)生,二茂鐵的氧化還原反應(yīng)受到抑制,使得其峰電流減小直到消失(見(jiàn)圖5).此外,隨著銅離子的量增加,銅離子的陽(yáng)極峰電位正移動(dòng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程符合ECE反應(yīng)機(jī)理.而另一方面,單獨(dú)的GPR與銅離子作用,其電化學(xué)信號(hào)無(wú)明顯變化,峰電位基本不變(如圖6所示).說(shuō)明二茂鐵基團(tuán)具有良好的電化學(xué)活性,GPR三肽與Cu(II)作用可以通過(guò)其電化學(xué)性質(zhì)的變化而得到.

3 結(jié)論

(1)以二茂鐵甲酸、H-Gly-OMe、Boc-Pro-OH、HArg(NO2)-OMe為原料,合成了一種目前尚未報(bào)道的新的化合物Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe.經(jīng)IR、1HNMR和MS表征確定其結(jié)構(gòu);利用循環(huán)伏安研究了該化合物在甲醇溶液中的電化學(xué)性質(zhì).

(2)利用循環(huán)伏安法和微分脈沖伏安法研究了Fc-GPR,GPR與銅離子的作用,采用摩爾比列法，得到Fc-GPR與Cu(II)的配位比為2∶1.當(dāng)Fc-GPR與Cu(II)絡(luò)合物的循環(huán)伏安圖是一個(gè)典型的雙波圖,其電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程符合偶合均相電化學(xué)反應(yīng)的ECE機(jī)理.

(3)將具有良好氧化還原活性的二茂鐵基團(tuán)標(biāo)記三肽GPR,為研究金屬離子與多肽的相互作用機(jī)制提供了一種新的方法.目前,我們正將Fc-GPR作為電化學(xué)探針,研究Cu(II)與Aβ的相互作用機(jī)制;并將其作為螯合肽與人體內(nèi)過(guò)量銅離子結(jié)合,抑制因過(guò)量銅離子引起的Aβ聚集,從而達(dá)到治療阿爾茨海默病的目的.

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Synthesis of Ferrocenoyl-Labeled Tripeptide Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe and Its Interaction with Cu(II)

LIU Xiao-Fang LI Xue-Qiang YE Wu-Long ZHOU Bin-Bin LIU You-Nian*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,P.R.China)

N-ferrocenoyl-labeled tripeptide Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe(Fc-GPR)was synthesized from ferrocenecarboxylic acid,glycine(H-Gly-OMe),proline(Boc-Pro-OH)and arginine(H-Arg(NO2)-OMe)by solution synthesis with a yield of 48.1%.The synthesized Fc-GPR was characterized by infrared spectroscopy(IR),proton nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H-NMR)and electrospray ionization mass spectroscopy(ESI-MS).The electrochemical behavior of Fc-GPR was investigated using electrochemical methods.We observed a pair of well-defined voltammetric peaks with cathodic Epcand anodic peak potentials Epa,at 0.552 and 0.624 V(vs Ag/AgCl),respectively.The ratio of oxidative to reductive peak current is 1.13 and the peak currents were found to be proportional to the square root of the scan rates suggesting that Fc-GPR undergoes a reversible electron transferreaction.The molarratio of Fc-GPR to Cu(II)was found to be 2:1 by the molar ratio method.Furthermore,the electrode reaction of Fc-GPR with Cu(II)is an electrochemicalchemical-electrochemical(ECE)process.

Ferrocene-peptide;Solution synthesis;Gly-Pro-Arg;Electrochemical-chemical-electrochemical process;Cu(II)

O641

Received:March 9,2010;Revised:April 18,2010;Published on Web:June 25,2010.

*Corresponding author.Email:liuyoun@mail.csu.edu.cn;Tel:+86-731-88836964.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20876179).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20876179)資助項(xiàng)目

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