李 航，魏志奇(解放軍第452醫(yī)院藥劑科，成都市 610021)

鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液是目前臨床應(yīng)用十分廣泛的抗生素，可對(duì)抗由敏感菌引起的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化及皮膚軟組織等的急、慢性感染，其安全性也廣為關(guān)注。在注射劑的熱原檢查中，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法較家兔法快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，且重現(xiàn)性好，更適用于該藥品中間體及成品的大規(guī)模熱原檢查。此外，筆者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液原液對(duì)鱟試劑存在干擾，為了探求準(zhǔn)確度高和精密度好的方法，保障安全用藥，筆者研究了鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液應(yīng)用鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的具體方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

YKH－I型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);D2KW－4電子恒溫水浴鍋(北京中興儀器有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)0802290，規(guī)格10 EU/支);鱟試劑(廈門鱟試劑廠，批號(hào) 070815，規(guī)格 0.5 EU·mL－1;批號(hào) 081013，規(guī)格 0.25 EU·mL－1);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)0906102，規(guī)格0.25 EU·mL－1);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號(hào)070803，規(guī)格2 mL/支);鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液(解放軍第452醫(yī)院自制，規(guī) 格 為 100 mL:0.1 g，批 號(hào) 08120102、09022701、09092401)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限度確定

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有關(guān)方法［1］規(guī)定:細(xì)菌內(nèi)毒素限度 L=K/M，K為規(guī)定的給藥途徑，臨床無任何不良反應(yīng)的內(nèi)毒素閾劑量，以 EU·kg－1表示。靜脈(包括 im、ip、sc、ia)K 值為 5.0 EU·kg－1。M為每 kg體重每小時(shí)最大供試品劑量，說明書注意事項(xiàng)中提到“本品靜脈滴注速度每100 mL至少60 min”，可能跟滴注過快容易引起靜脈刺激癥狀有關(guān)，因此設(shè)每小時(shí)人體最多可以接受的量為100 mL，人均體重按60 kg計(jì)，則M=3 EU·mL－1。此值過高，考慮到臨床用藥的安全及一般大輸液細(xì)菌內(nèi)毒素限度大多為0.5 EU·mL－1，將本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限度同樣定為 0.5 EU·mL－1。

2.2 鱟試劑靈敏度(λb)復(fù)核

根據(jù)鱟試劑的靈敏度標(biāo)識(shí)值(λb)，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后置混合器上混合15 min，然后將其制備成 2 λb、1 λb、0.5 λb、0.25 λb4 個(gè)濃度。每個(gè)濃度平行做4份。鱟試劑靈敏度測定值λc為0.5～2.0 λb，本批鱟試劑的靈敏度合格，可用于供試品的干擾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

2.3.1 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn):細(xì)菌內(nèi)毒素限度值為0.5 EU·mL－1，按 MVD=CL/λ計(jì)算出 TAL靈敏度為0.5 EU·mL－1時(shí)的 MVD為1倍，用BET用水對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋，作為供試品溶液陰性對(duì)照。用上述各稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作品稀釋成含2 λ內(nèi)毒素的供試品溶液陽性對(duì)照，選擇標(biāo)示靈敏度為0.5 EU·mL－1的鱟試劑進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做陽性對(duì)照(PC)和陰性對(duì)照(NC)。結(jié)果供試品2倍稀釋時(shí)不干擾測定，見表2。

表1 鱟試劑的靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)Tab1 Recheck test of sensitivity of tachypleus amebocyte lysate

表2 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab2 Results of preliminary experiment of interference test

2.3.2 干擾實(shí)驗(yàn):預(yù)干擾實(shí)驗(yàn)中得出MVD=2，即內(nèi)毒素限度為 λ=L/MVD=0.5/2=0.25，故選用靈敏度 λc為 0.25 EU·mL－1的鱟試劑。取3批樣品，分別進(jìn)行2倍稀釋，取樣品稀釋液及BET用水分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU·mL－1兩個(gè)系列濃度，采用兩個(gè)廠家的鱟試劑與上述兩個(gè)系列內(nèi)毒素溶液反應(yīng)。Et在0.5～2.0 Es范圍內(nèi)，說明樣品稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾，結(jié)果見表3。

表3 供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab3 Results of interference test of samples

2.4 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測

取3批供試品，樣品使用2倍稀釋液，采用靈敏度為0.25 EU·mL－1鱟試劑，按表4制備溶液，按《中華人民共和國藥典》附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［1］檢查，結(jié)果符合規(guī)定;同時(shí)進(jìn)行3批樣品的家兔法檢測，結(jié)果相符合，見表5。

表4 供試品溶液的制備Tab4 Preparation of sample solution

表5 鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液內(nèi)毒素檢查與家兔熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab5 Endotoxin test and rabbit pyrogen test on Levofloxacin Hydrochloride and Sodium Chloride Injection

3 討論

在注射液的熱原檢查中，家兔法存在生物學(xué)差異、試驗(yàn)時(shí)間長、成本高等缺點(diǎn)，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏度高、快速、設(shè)備簡單等特點(diǎn)。

通過干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了樣品的測定濃度為0.5 mg·mL－1，通過正式干擾實(shí)驗(yàn)確定該濃度對(duì)0.25 EU·mL－1的鱟試劑不存在抑制效果，并研究了3批鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況，與家兔法對(duì)比，結(jié)果鱟試劑法與家兔法的結(jié)果一致，且鱟試劑法靈敏度高，操作簡便。因此，可以用鱟試劑法檢查鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素。

［1］國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄85～88.