楊文軍劉 霞楊 麗朱培蕾程莉莉杜先鋒

(安徽農(nóng)業(yè)大學食品科學工程系1，合肥 230036)

(安徽省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所2，合肥 230031)

馬鈴薯淀粉制備磷酸寡糖的研究

楊文軍1劉 霞1楊 麗1朱培蕾2程莉莉1杜先鋒1

(安徽農(nóng)業(yè)大學食品科學工程系1，合肥 230036)

(安徽省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所2，合肥 230031)

以馬鈴薯淀粉為原料，采用全酶法并借以噴射液化工藝制備低DE值的麥芽低聚糖漿，采用高效陰離子交換色譜法測定所制備樣品的糖分組成，離子樹脂交換法從中分離制備磷酸寡糖，最后，采用薄層層析法和紅外光譜法對其進行定性分析。結(jié)果表明:制備液化DE值16%，糖化DE值35%的糖液，其中，主要成分為麥芽二糖至麥芽七糖，以二糖至五糖居多。201×4強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂分離效果好，分離條件為:洗脫液為0.4 mol/L NaCl，洗脫速度為1.4 mL/min。經(jīng)紅外光譜定性分析，結(jié)果顯示樣品為結(jié)合有磷酸基團的糖類物質(zhì)。

馬鈴薯淀粉 磷酸寡糖 分離 定性分析

寡糖(oligosacchride)也叫低聚糖，是指由2～10個單糖通過糖苷鍵連接而形成的直鏈或支鏈的低度聚合物。根據(jù)寡糖的生物學功能又可將其分為功能性寡糖和普通寡糖兩大類，而功能性寡糖是指具有特殊的生理學功能，特別是不被人和動物小腸吸收并可以促進大腸中雙歧桿菌的增殖，有益于腸道健康的一類寡糖——雙歧因子，其可以抑制腸內(nèi)有害菌及病原菌的繁殖、促進蠕動、防治便秘、增加人體對礦物的吸收和維生素的合成以及提高機體抗病免疫功能［1］。

磷酸寡糖(Phosphorylated oligosaccharides)的概念最早是由Kamasaka H等于1995年提出的，他們在生產(chǎn)淀粉糖的廢液中，發(fā)現(xiàn)了這種新物質(zhì)。在對其結(jié)構(gòu)進行分析以后發(fā)現(xiàn)，這是由麥芽低聚糖中的葡萄糖殘基與磷酸根共價連接得到的一類低聚糖，由于其結(jié)合有磷酸根，因此，其整個基團帶有負電荷，Kamasaka H等人將其命名為Phosphorylated oligosaccharides(POs)，即磷酸寡糖。在以后的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，磷酸寡糖具有對人體健康有益的特殊生理功能，它在弱堿性條件下能與鈣離子結(jié)合成可溶性復合物，抑制不溶性鈣鹽的形成，從而提高小腸中有效鈣離子的濃度，促進人體對鈣質(zhì)的吸收，且不被口腔微生物發(fā)酵利用，它還有加強牙齒釉質(zhì)再礦化的作用，達到防止齒質(zhì)損害的效果，同時還具有抗淀粉老化的功效［2］。日本已有磷酸寡糖的商業(yè)化產(chǎn)品問世，而我國對其重視較晚，當前僅有關(guān)于POs的少量報道［3－4］。

本試驗利用全酶法并結(jié)合使用低壓蒸汽噴射液化技術(shù)，使液化徹底，制備出低DE值的麥芽低聚糖漿。同時，使用201×4強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂從所制備的麥芽低聚糖漿中分離出磷酸寡糖，并采用薄層層析法和紅外光譜法對其進行定性分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯淀粉:寧夏固原亞雪淀粉集團有限公司;耐高溫 α－淀粉酶(20 900 U/mL)、普魯蘭酶(18 650 U/mL):無錫杰能科生物工程公司;真菌淀粉酶(800 FAU/g):諾維信公司;葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖標準品:Sigma公司;氫氧化鈉和乙酸鈉:優(yōu)級純，其他藥品及試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器及耗材

ICS3000高效陰離子色譜、脈沖安培檢測器、CarboPac PA100 2－mm分析柱和保護柱:美國戴安公司;NEXUS－870傅立葉紅外光譜儀:美國尼高力儀器公司;層析柱(3.0 cm×60 cm):上海錦華層析設(shè)備廠;自動收集器:上海滬西分析儀器廠;低壓噴射液化器、配料罐、層流管、糖化罐:安徽樂健集團提供使用;阿貝折光儀:上海光學儀器五廠;冷凍干燥機:北京德天佑科技發(fā)展有限公司;201×4強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂:安徽三星樹脂科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備低DE值麥芽低聚糖漿

1.3.1.1 工藝路線如下:

馬鈴薯淀粉→調(diào)漿→配料→調(diào)節(jié)pH值→加液化酶→低壓蒸汽噴射液化→一次板框壓濾→液化保溫→快速冷卻→加真菌酶糖化→二次板框壓濾→活性碳脫色→檢測

1.3.1.2 具體操作步驟

向配料罐里注入水，而后在不斷攪拌下，徐徐投入1 t原料淀粉，用玻美計進行在線檢測，直到漿料濃度為10°Be，然后加入0.6～0.7 kg CaCl2做為酶活促進劑，用HCl和NaCO3將漿料調(diào)至pH 5.4，加入100 mL新型耐高溫α－淀粉酶。料液攪拌均勻后，用泵將物料泵入噴射液化器，在噴射器中，粉漿和蒸汽直接充分相遇，噴射溫度110℃，并維持4～8 min，控制出料溫度為95～97℃。噴射液化后的料液進入層流罐，在95℃條件下保溫30 min，碘試反應顯碘本色時，通蒸汽滅酶。同時經(jīng)過一次板框壓濾，開始壓力應不低于0.6 MPa，待濾餅形成阻力增大時再增加壓力，但以不超過2 MPa為宜，料液應保持一定得溫度，以增加其流動性，但不應高于100℃。將料液冷卻至60℃，向糖化罐中加入100 mL真菌淀粉酶和50 mL普魯蘭酶，調(diào)節(jié)pH值為5.2，反應2～4 h，然后通入高壓蒸汽100℃條件下滅酶2～3 h。糖化后糖液隨著管道進入脫色罐，罐中含有活性碳，保持罐溫為80℃左右，糖液通入后，在不斷攪拌的情況下，活性碳吸附糖液所含的色素以及部分無機鹽，隨后活性碳隨同糖液一并進入板框壓濾機，經(jīng)過壓濾除去活性碳。

1.3.1.3 麥芽低聚糖DE值的測定［5－6］

DE值=(還原糖含量/干物質(zhì)含量)×100%

還原糖含量采用直接滴定法進行測定;干物質(zhì)量(總固形物含量)使用阿貝折光儀測定。

1.3.2 麥芽低聚糖糖組分的檢測

采用HPAEC－PAD方法測定所制備的麥芽低聚糖漿的糖分組成，以麥芽低聚糖標準品為對照，進行分析檢測［7］。

1.3.2.1 離子色譜條件

色譜柱:CarboPac PA100 2－mm分析柱和保護柱;柱溫:30℃;檢測器:脈沖安培檢測器PAD;流動相:A:100%水;B:100 mmol/L氫氧化鈉，200 mmol/L乙酸鈉;進樣體積:25 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 麥芽低聚糖漿梯度洗脫條件

1.3.2.2 標準溶液的配制

稱取葡萄糖和麥芽二糖～麥芽七糖標準品(分別用G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7表示)約10 mg，用100 μL的超純水溶解，混和均勻，用0.45 μm的濾膜過濾。

1.3.2.3 麥芽低聚糖樣品處理

取制備的麥芽低聚糖樣品，離心除去蛋白質(zhì)，而后，使用阿貝折光儀測其固形物含量(約等于其中糖含量)，最后將其稀釋至0.05%，用0.45 μm的濾膜過濾。

1.3.3 201×4強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂分離磷酸寡糖

201×4強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂活化后，使用移液器吸取麥芽低聚糖液上樣。首先用去離子水將未被吸附的中性糖洗去，再使用0.4 mol/L NaCl洗脫被吸附的磷酸寡糖，使用自動收集器收集流出液。苯酚－硫酸法檢測收集管中的收集液的糖含量，最后將出峰處各管合并收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，采用透析袋脫鹽處理，最后，冷藏條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.1 中性糖的洗脫

中性糖不被離子交換樹脂吸附，使用去離子水將其洗脫掉，苯酚－硫酸法檢測流出液中的糖含量，直至檢測不出糖為止。洗脫流速為1.4 mL/min。

1.3.3.2 洗脫劑濃度的選擇

中性糖被洗脫完以后，以NaCl溶液洗脫磷酸寡糖，考察不同濃度洗脫劑對洗脫效果的影響，最終確定最佳洗脫劑濃度。采用苯酚－硫酸法檢測收集管中的糖含量，并以洗脫管數(shù)與吸光度繪制洗脫曲線。

濃度選擇:0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl;流速1.4 mL/min，每管收集10 min;上樣量:麥芽低聚糖液(固形物含量55%，DE值35%)1.5 mL。

1.3.3.3 洗脫速度的選擇

以0.4 mol/L NaCl溶液洗脫磷酸寡糖，考察不同洗脫速度對洗脫效果的影響，以確定最佳洗脫速度。采用苯酚－硫酸法檢測收集管中的糖含量，并以洗脫管數(shù)與吸光度繪制洗脫曲線。

洗脫液:0.4 mol/L NaCl;流速選擇:0.8、1.4、2.0 mL/min，每管收集10 min;上樣量:麥芽低聚糖液(固形物含量55%，DE值35%)1.5 mL。

1.3.4 磷酸寡糖的薄層層析

將分離制備的磷酸寡糖樣液進行薄層分析。展開劑為乙酸乙酯∶甲醇∶水∶氨水=10∶18∶2∶3;顯色劑:苯胺－二苯胺－磷酸;樣品濃度為0.4%，點樣量為2 μL。

1.3.5 磷酸寡糖的結(jié)構(gòu)分析

將收集的磷酸寡糖樣品，濃縮脫鹽處理后，使用冷凍干燥機將其凍干，然后將凍干樣品和馬鈴薯淀粉磷酸酯樣品通過溴化鉀壓片法進行紅外光譜分析，將二者紅外光譜圖進行對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備低DE值麥芽低聚糖漿

麥芽低聚糖漿相關(guān)理化指標如表2所示。

表2 麥芽低聚糖理化指標

工業(yè)上用DE值(亦稱葡萄糖值)來控制淀粉水解程度，并且表示所制備的淀粉糖的糖分組成［5］。DE值低，就說明所制備糖液中葡萄糖含量低，而麥芽低聚糖含量則高。磷酸寡糖為內(nèi)含磷酯鍵的麥芽三糖～麥芽六糖的混合物，由此可見，低DE值有利于磷酸寡糖前體物質(zhì)的制備。所以，采用全酶法并借以低壓蒸汽噴射液化技術(shù)，制得了液化DE值為16%，糖化DE值為35%的麥芽低聚糖漿，經(jīng)壓濾及活性碳脫色后，糖液清亮透明，無雜質(zhì)，且穩(wěn)定性良好。

2.2 麥芽低聚糖糖組分的檢測

采用HPAEC－PAD對所制備的麥芽低聚糖糖組分進行分析。圖1為標準品與所制備樣品的高效陰離子色譜圖，表3為兩者保留時間對照表。比較兩圖譜中各糖組分的保留時間，樣品中各糖分的保留時間與相對應的標品組分保留時間的差值均在1 min之內(nèi)，相對誤差最大為3.026%，均小于4%。由此，可以得出試驗制備的麥芽低聚糖漿中含G1～G7這幾種組分，并由圖1可以看出，其中以G2～G5居多，葡萄糖含量很少，對試驗進行非常有利。

圖1 麥芽低聚糖樣品與標準品高效陰離子色譜圖

表3 樣品與標品保留時間對照表

2.3 磷酸寡糖的分離

2.3.1 中性糖的洗脫

中性糖洗脫曲線如圖2所示。

圖2 中性糖洗脫曲線

由洗脫曲線看出，中性糖可以被去離子水很好的洗脫掉。將出峰部分的收集液進行濃縮，而后采用磷鉬藍法檢測磷含量，結(jié)果顯示沒有磷存在，說明磷酸寡糖很好的被樹脂所交換。

2.3.2 洗脫劑濃度的選擇

不同濃度的NaCl溶液對磷酸寡糖的洗脫效果曲線如圖3所示。

圖3 不同濃度洗脫劑對磷酸寡糖的洗脫曲線

由圖3看出，3種濃度的洗脫劑對磷酸寡糖的洗脫效果基本相同，其中，0.6 mol/L NaCl洗脫時，峰值最大。但由于過高的鹽含量對磷酸寡糖的脫鹽處理帶來一定困難，并且考慮到配制洗脫劑的成本問題，優(yōu)選0.4 mol/L NaCl作為磷酸寡糖的洗脫劑。

2.3.3 洗脫速度的選擇

不同洗脫速度對磷酸寡糖的洗脫效果曲線如圖4所示。

圖4 不同洗脫速度洗脫磷酸寡糖的洗脫曲線

由圖4可以看出，不同洗脫速度對磷酸寡糖的洗脫效果差別較大，以1.4 mL/min的洗脫速度為最佳，再加大速度，洗脫峰值反而降低。這可能因洗脫速度過快，被吸附在樹脂上的磷酸寡糖難以及時洗脫下來?？紤]各方面因素，選擇1.4 mL/min為磷酸寡糖的最佳洗脫速度。

2.4 磷酸寡糖的薄層層析

經(jīng)離子交換分離后的磷酸寡糖樣品，將其濃度稀釋為0.4%，進行薄層層析。圖5為磷酸寡糖的薄層層析圖。

圖5 磷酸寡糖的薄層層析圖

由圖5可以看出，各樣點在硅膠板上展開和顯色效果相對較好，標樣和1、2樣點中G6、G7兩點沒有展開，可能是由于糖分子質(zhì)量太大，展開劑極性不夠大;1、2樣點均為磷酸寡糖樣品，其各個顯色點對應于標樣均顯滯后，是由于其結(jié)合磷酸根從而使分子量增大的緣故，由此我們可以推斷出磷酸寡糖含有結(jié)合有磷酸根的G2～G7這幾種糖組分。

2.5 磷酸寡糖的紅外光譜分析

離子交換分離后的磷酸寡糖樣品，經(jīng)濃縮、脫鹽和凍干處理后，通過溴化鉀壓片法進行紅外光譜結(jié)構(gòu)分析。圖6a為馬鈴薯淀粉磷酸酯的紅外光譜圖，圖6b為磷酸寡糖紅外譜圖。

圖6 馬鈴薯淀粉磷酸酯及磷酸寡糖紅外光譜圖

對圖6a和圖6b進行對照分析，發(fā)現(xiàn)在1 080和928 cm－1左右，均有磷脂鍵特征峰出現(xiàn)。根據(jù)紅外光譜圖庫對兩者進行分析表明:1 080 cm－1處有P—O—C基團的伸縮振動吸收峰，928 cm－1處有5價磷的P—O伸展振動。此外，在3 000～2 800 cm－1區(qū)域內(nèi)的吸收峰是糖類的特征峰，2 930 cm－1是次甲基(—CH2—)中C—H伸縮振動的吸收峰，1 420 cm－1處是羰基的CO伸縮振動引起的吸收峰，768 cm－1處是D－葡萄吡喃糖環(huán)C—O—C振動吸收峰，由此可以推斷出該產(chǎn)品即為結(jié)合有磷酸基團的寡糖類物質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 采用全酶法并借以低壓噴射液化技術(shù)可以使淀粉液化徹底，有利于得到低DE值的糖漿，有效控制糖液中葡萄糖的含量。本試驗制備的麥芽低聚糖漿，其液化DE值為16%，糖化DE值35%，通過HPAEC－PAD對其糖分進行檢測，結(jié)果表明，所制備的糖液中含有葡萄糖及麥芽二糖至麥芽七糖，但以麥芽二糖至麥芽五糖居多，葡萄糖含量甚微，非常有利于磷酸寡糖的制備研究。

3.2 以201×4強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂從麥芽低聚糖中分離制備磷酸寡糖，考察了不同洗脫液濃度和洗脫速度對洗脫效果的影響，最終確定了201×4洗脫磷酸寡糖的最佳工藝條件:洗脫劑為0.4 mol/L NaCl，洗脫速度為1.4 mL/min。

3.3 通過對所制備的磷酸寡糖樣品進行薄層層析，可以看出，各樣點在硅膠板上展開和顯色效果相對較好，標樣中G6、G7兩點沒有展開，可能是由于糖分子量太大，展開劑極性不夠大;1、2樣點均為磷酸寡糖樣品，其各個顯色點對應于標樣均顯滯后，可能是由于其結(jié)合磷酸根從而使分子質(zhì)量增大的緣故，由此我們可以推斷出磷酸寡糖含有結(jié)合有磷酸根的G2～G7這幾種糖組分。

3.4 通過紅外光譜對所制備的磷酸寡糖進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明:樣品在1 080 cm－1處有P—O—C基團的伸縮振動吸收峰，928 cm－1處有5價磷的P—O伸展振動。此外，在3 000～2 800 cm－1區(qū)域內(nèi)的吸收峰是糖類的特征峰，2 930 cm－1是次甲基(—CH2—)中C—H伸縮振動的吸收峰，1 420 cm－1處是羰基的CO伸縮振動引起的吸收峰，768 cm－1處是D－葡萄吡喃糖環(huán)C—O—C振動吸收峰，由此可以推斷出該產(chǎn)品即為結(jié)合有磷酸基團的寡糖類物質(zhì)。

［1］林海霞，張桂，王丹兵.功能性糖的生理功效［J］.中國食品工業(yè)，2006(6):53－54

［2］Kamasaka H，To－O K，Kusaka K，et al.The Structures of Phosphoryl Oligosaccharides Preparedfrom Potato Starch［J］.Biosci Biotech Biochem，1997，61(2):238－244

［3］毛根年，楊亞洲，許牡丹，等.磷酸寡糖前體——麥芽低聚糖制備工藝的研究［J］.陜西科技大學學報，2003，21(6): 21－24

［4］朱培蕾，汪名春，杜先鋒.新型功能性低聚糖——磷酸寡糖的功能特性及應用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(7): 107－110

［5］尤新.淀粉糖品生產(chǎn)與應用手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1999:93－94

［6］GB/T5009.7—2003.食品中還原糖的測定［S］

［7］GB/T21533—2008.蜂蜜中淀粉糖漿的測定——離子色譜法［S］.

Preparation of Phosphoryl Oligosaccharides from Potato Starch

Yang Wenjun1Liu Xia1Yang Li1Zhu Peilei2Cheng Lili1Du Xianfeng1
(Department of Food Science and Technology，Anhui Agricultural University1，Hefei230036)
(Institute of Horticulture，Academy of Anhui Agricultural Science2，Hefei 23003)

Malt－oligosaccharides with low dextrose equivalent(DE)was prepared from potato starch by using the fully enzymatic method and steam ejection liquefaction.Sample composition was detected using high performance anion－exchange chromatography，and phosphoryl oligosaccharides(POs)were separated from malt－oligosaccharides with the ion－exchange method.Finally，the POs were analyzed by thin－layer chromatography and infrared spectrum.Results:The DE values of the prepared liquefied and saccharified malt－oligosaccharides are 16%and 35%，respectively，and a majority of the product is malt－oligosaccharides of disaccharide to pentose.The optimal conditions to separate POs are using 201×4 ion－exchange resin for separation，and eluting the column with 0.4 mol/L NaCl at a speed of 1.4 mL/min.IR analysis indicates the product is phosphate groups bound saccharides.

potato starch，phosphoryl oligosaccharides，separation，analysis

TS245.9 文獻標識碼:A 文章編號:1003－0174(2010)11－0052－05

863計劃(2006AA10Z340)

2009－11－23

楊文軍，男，1984年出生，研究生，食品生物技術(shù)及農(nóng)副產(chǎn)品深加工

杜先鋒，男，1967年出生，教授，博士生導師，食品生物技術(shù)及農(nóng)副產(chǎn)品深加工