吳 瑕江連洲王 鑫王晰銳

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院1，哈爾濱 150030)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，哈爾濱 150030)

大豆蛋白酶水解物抗氧化活性的研究

吳 瑕1江連洲2王 鑫2王晰銳2

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院1，哈爾濱 150030)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，哈爾濱 150030)

采用堿性蛋白酶水解大豆蛋白，研究大豆蛋白酶水解物的抗氧化活性。通過(guò)測(cè)定水解物的亞鐵還原能力，對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的氧化抑制作用，DPPH(二苯代苦味肼基)自由基清除能力，研究大豆多肽抗氧化活性的大小。結(jié)果表明，大豆多肽的抗氧化能力與底物濃度、加酶量、水解時(shí)間、pH值、溫度等有關(guān)，水解的最佳工藝條件是底物質(zhì)量濃度50 mg/mL，pH 8.0，加酶量(E/S)2%，溫度60℃，水解時(shí)間為5 h。研究表明，堿性蛋白酶制備的大豆蛋白水解物，在卵磷脂脂肪氧化體系中可以降低硫代巴比妥酸值(TBARS)，且具有較好的清除DPPH自由基的能力。

大豆蛋白 抗氧化活性 堿性蛋白酶 酶水解物

脂質(zhì)過(guò)氧化是典型的衰老事件，與食品、飼料加工關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)破壞食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，甚至誘發(fā)疾病。尋找能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的抗氧化劑一直是營(yíng)養(yǎng)生物化學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。目前使用的抗氧化劑大多是化學(xué)合成物如BHA、BHT，雖抗氧化效果良好，但對(duì)人體肝、脾、肺有害，具有蓄積性致癌作用［1］。因此，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑，如抗壞血酸、生育酚、胡蘿卜素、兒茶精類(lèi)等，某些蛋白質(zhì)也具抗氧化活性［2－4］，運(yùn)用各種蛋白酶水解蛋白所得產(chǎn)物中存在多種抗氧化肽，它們具較強(qiáng)抑制生物大分子過(guò)氧化和清除體內(nèi)自由基的功能。

近年來(lái)，關(guān)于蛋白水解物抗氧化性的研究已有許多報(bào)道，如乳蛋白［5］、玉米醇溶蛋白［6］、麥胚蛋白［7］、魚(yú)類(lèi)蛋白［8］、雞蛋卵白蛋白［9］、豬血蛋白［10］等。本試驗(yàn)研究堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白制備大豆抗氧化多肽的最佳水解條件和抗氧化活性。主要通過(guò)大豆蛋白水解物的還原能力來(lái)確定大豆蛋白水解的最佳工藝條件，并通過(guò)對(duì)大豆蛋白水解物在脂質(zhì)氧化體系中對(duì)TBARS的抑制作用和DPPH自由基清除能力進(jìn)一步對(duì)大豆蛋白多肽抗氧化機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

大豆分離蛋白:哈高科大豆食品有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶:丹麥諾維信公司;大豆卵磷脂、抗壞血酸、丁基羥基茴香醚(BHA)、三吡啶三吖嗪(2，4，－Tris(2－pyridyl)－s－triazine，TPTZ)、二苯代苦味肼基自由基(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl，DPPH):美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白水解物的制備

將大豆蛋白溶解后，調(diào)節(jié)溶液pH值、溫度至最適條件，加入堿性蛋白酶，反應(yīng)過(guò)程中不斷加入1 mol/L的NaOH，使 pH值保持恒定，記錄耗堿量(mL)，用于計(jì)算水解度(degree of hydrolysis，DH)，待水解結(jié)束后沸水浴5 min使酶滅活，水解液用來(lái)測(cè)定抗氧化能力。

1.2.2 水解度的測(cè)定

根據(jù) pH －Stat法［11］，水解度計(jì)算公式為DH=h/htot

式中:h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量(mmol/g);htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，對(duì)大豆分離蛋白，該值取7.8。

1.2.3 亞鐵還原能力的測(cè)定

參照 Benzie等［12］的方法。取3.0 mL新配的FRAP(亞鐵還原能力，F(xiàn)erric Reducing Ability of Power)試劑(由pH 3.6的300 mmol/L醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L的TPTZ溶液2.5 mL和20 mmol/L的FeCl3·6H2O溶液2.5 mL混合在一起組成)加熱到37℃，向其中加入0.1 mL大豆蛋白水解物，0.3 mL的H2O，室溫反應(yīng)10 min，在593 nm讀取吸光度值。以100～1 000 μmol/L的FeSO4·7H2O制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4·7H2O物質(zhì)的量表示。同時(shí)以未水解的大豆蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，采用BHA和抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 脂肪氧化體系的制備

卵磷脂脂質(zhì)體氧化體系(soybean phosphatidylcholine liposome)，采用Decker等［13］的方法并進(jìn)行一些改進(jìn)。將大豆卵磷脂(0.2 g/L)溶解在濃度為0.12 mol/L的 KCl，5 mmol/L組氨酸緩沖溶液(pH 6.8)中，均質(zhì)后，在 4℃進(jìn)行超聲波處理45 min［14］。對(duì)照用1 mL水代替1 mL樣品溶液與5 mL的脂質(zhì)體溶液混合，同時(shí)以未水解的大豆蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，以未水解蛋白作為陰性對(duì)照，以BHA和抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。脂質(zhì)氧化由鐵的氧化還原反應(yīng)引發(fā)，將0.1 mL濃度為50 mmol/L的FeCl3和0.1 mL濃度為10 mmol/L抗壞血酸鹽加入脂質(zhì)體氧化體系中。樣品在37℃水浴中保溫1 h，并迅速測(cè)定TBARS值。

1.2.5 硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)的測(cè)定

參照Sinnhuber等［15］的方法，并作適當(dāng)?shù)男薷?。? mL樣品加入3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸－鹽酸溶液，混勻后，沸水浴中反應(yīng)30 min，冷卻，取5 mL樣品加入等體積的氯仿，3000 r/min下離心10 min，532 nm下讀取吸光值。TBARS值以每升脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛的毫克數(shù)表示。

TBARS(mg/L)=(A532/Vs)×9.48

式中:A532為溶液的吸光值;Vs為樣品的體積; 9.48為常量，與硫代巴比妥酸反應(yīng)物的稀釋倍數(shù)和摩爾消光系數(shù)有關(guān)。

1.2.6 對(duì)DPPH穩(wěn)定自由基的清除

參照Yen等［16］的方法。在反應(yīng)管中加入1.0 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，再加入4 mL不同濃度的大豆蛋白水解液，混合均勻，黑暗下室溫避光反應(yīng)30 min后在517 nm處讀取吸光度值，同時(shí)以未水解蛋白作為陰性對(duì)照，以BHA和抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。

清除率=［1－(A1－A2)/A3］×100%

式中:A1為4 mL水解液+1 mL DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度;A2為4 mL水解液+1 mL乙醇的吸光度;A3為4 mL乙醇+1 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件進(jìn)行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Turkey HSD程序，采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解時(shí)間的水解度

堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白，不同水解時(shí)間的水解度見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度(DH)不斷增大，但其增長(zhǎng)速度不同，水解初期水解度迅速增加，水解5 h以后，水解度變化趨于平緩。水解0.5 h時(shí)，大豆蛋白的水解度為8.00%，水解5 h時(shí)，其水解度則達(dá)到18.56%，水解8 h時(shí)，水解度為19.71%。

圖1 不同水解時(shí)間的水解度

2.2 底物質(zhì)量濃度與抗氧化活性的關(guān)系

試驗(yàn)選用的底物質(zhì)量濃度為 10、20、30、50、80 mg/mL，E/S為2%，pH 7.0，溫度60℃，水解時(shí)間為5 h，測(cè)定水解液的TBARS值、FRAP值和DPPH清除自由基能力來(lái)確定底物濃度對(duì)水解物抗氧化效果的影響。

由圖2a可以看出，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，水解物的還原能力增加，底物質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)還原能力為 183.38 μmol/L，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，其值達(dá)到了823.38 μmol/L，還原能力增加4.5倍，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為80 mg/mL時(shí)，還原能力為1 034.63 mg/mL，比50 mg/mL時(shí)僅增加1.25倍，所以選擇底物質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)為最佳底物濃度。

由圖2b不同底物質(zhì)量濃度的大豆蛋白水解物脂質(zhì)氧化體系的抑制曲線趨勢(shì)來(lái)看，TBARS值隨著底物質(zhì)量濃度的增加而降低，即對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/mL，TBARS值降至最低，即對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為 80 mg/mL時(shí)，TBARS值又有所升高，即抑制作用減弱。隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶水解物對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增大，但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度增大到80 mg/mL時(shí)，其變化就較平緩。

從這3個(gè)指標(biāo)綜合來(lái)看，底物質(zhì)量濃度50 mg/mL時(shí)，抗氧化作用最好，通過(guò)以上分析，選定50 mg/mL為最佳底物質(zhì)量濃度。

圖2 不同蛋白濃度大豆蛋白水解物的抗氧化水平

2.3 加酶量與抗氧化活性的關(guān)系

在pH 7.0，溫度60℃，底物質(zhì)量濃度50 mg/mL條件下，加酶量(E/S)分別為0.5%、1%、2%、3%、5%，水解5 h，測(cè)定水解液的FRAP值、TBARS值和DPPH清除自由基能力。

由圖3a水解液還原能力隨加酶量(E/S)的變化曲線可以看出，隨著加酶量的增加，水解物的還原能力增加，加酶量從0.5%增加到1%時(shí)，還原能力增加了0.94倍(615.88～657.13 μmo/L)，加酶量從1%增加到2%時(shí)還原能力增加了1.25倍，(657.13～823.38 μmo/L)，加酶量繼續(xù)增加時(shí)，酶解物的還原能力增加，但增加的幅度較平緩。

由圖3b可以看出在底物濃度確定的條件下，隨著加酶量(E/S)的增大，TBARS值總體為下降趨勢(shì)，即水解液對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)加酶量在3%，TBARS值降至最低，即抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)加酶量在5%時(shí)，TBARS值略有回升，即抑制作用減弱。當(dāng)加酶量在0.5%～2%時(shí)，DPPH自由基清除能力由42.71%迅速增加到68.47%，在3%時(shí)為69.83%，增加緩慢，但達(dá)到5%時(shí)，清除率略有下降，為69.49%。因此，綜合以上幾點(diǎn)，再加上考慮價(jià)格、成本等因素，選定加酶量(E/S)為2∶100。

圖3 不同加酶量(E/S)大豆蛋白水解物的抗氧化水平

2.4 水解時(shí)間與抗氧化活性的關(guān)系

在pH 7.0，溫度60℃，底物質(zhì)量濃度50 mg/mL，加酶量(E/S)2%條件下，反應(yīng)0.5、1、3、5、8 h，測(cè)定水解液的FRAP值、TBARS值和DPPH清除自由基能力。

由圖4a中可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解物的還原能力呈增加趨勢(shì)，從0.5 h到4 h，水解液的還原能力從629.63 μmol/L增加到714.63 μmol/L，增加了1.1倍，從4 h到5 h，還原能力由714.63 μmol/L增加到823.38 μmol/L，增加1.2倍，當(dāng)水解時(shí)間增加到8 h時(shí)，還原能力增加緩慢。由圖4b可以看出，TBARS值隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，即水解液對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)，當(dāng)水解時(shí)間從0.5 h到5 h時(shí)，TBARS值為由3.91 mg/L降低到2.74 mg/L，降低1.4倍，而由5 h延長(zhǎng)到8 h時(shí)，TBARS值僅降低0.99倍，降低程度趨于平緩。隨著水解時(shí)間的增加，DPPH自由基清除能力變化呈升高趨勢(shì)5 h的清除率達(dá)到68.47%，比0.5 h(44.07%)增加1.6倍，8 h水解液的清除能力(69.49%)比5 h略有增加。因此，綜合3個(gè)抗氧化指標(biāo)，確定水解時(shí)間為5 h。

圖4 不同水解時(shí)間大豆蛋白水解物的抗氧化水平

2.5 水解最佳溫度的確定

在pH 7.0，底物質(zhì)量濃度50 mg/mL，加酶量(E/S)2%條件下，采用不同的反應(yīng)溫度:55、60、65、70℃對(duì)大豆蛋白溶液進(jìn)行水解，水解5 h后測(cè)定水解液的FRAP值、TBARS值和DPPH清除自由基能力。

由圖5a可以看出，60℃水解液還原能力最強(qiáng)，其他3個(gè)溫度的水解液的還原能力相差不大。由圖5b也可以得到類(lèi)似的趨勢(shì)，60℃水解液的TBARS值最小，即對(duì)卵磷脂質(zhì)氧化體系抑制作用最強(qiáng)，其他3個(gè)溫度的水解液的還原能力相差不大。由DPPH清除能力曲線同樣可以看出60℃水解液清除率最高(68.47%)，其他3個(gè)溫度水解液的清除DPPH能力均低于60℃水解液。綜合圖5a，圖5b，得到最佳水解溫度為60℃。

圖5 不同水解溫度大豆蛋白水解物的抗氧化水平

2.6 水解最佳pH值的確定

在溫度60℃，底物質(zhì)量濃度50 mg/mL，加酶量(E/S)2%條件下，采用不同水解pH:pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5對(duì)大豆蛋白溶液進(jìn)行水解，水解5 h后測(cè)定水解液的FRAP值、TBARS值和DPPH清除自由基能力。

由圖6a可以看出，pH 8.0時(shí)水解液還原能力最強(qiáng)，其他3個(gè)pH的水解液的還原能力均小于pH 8.0水解液。由圖6b也可以得到相似的趨勢(shì)，pH 8.0水解液的TBARS值最小，即對(duì)卵磷脂質(zhì)氧化體系抑制作用最強(qiáng)，其他3個(gè)pH的水解液的TBARS值均大于pH 8.0水解液，即抑制作用弱于pH 8.0水解液。由DPPH清除能力曲線同樣可以看出pH 8.0水解液清除率最高(68.47%)，其他3個(gè)溫度水解液的清除DPPH能力均低于60℃水解液。綜合圖6a，圖6b，得到最佳水解pH為8.0。

在考察了底物質(zhì)量濃度、加酶量(E/S)、水解時(shí)間、水解溫度、水解pH對(duì)水解產(chǎn)物的抗氧化活性的影響，以及水解時(shí)間與水解度的關(guān)系，并綜合成本等經(jīng)濟(jì)因素，得出制備大豆蛋白肽的條件:pH值為8.0，溫度60℃，底物質(zhì)量濃度50 mg/mL，E/S= 2∶100，水解時(shí)間5 h。

圖6 不同加酶量(E/S)大豆蛋白水解物的抗氧化水平

2.7 大豆蛋白酶水解物與常用抗氧化劑的比較

試驗(yàn)過(guò)程中，以未水解大豆蛋白作為陰性對(duì)照，以BHA和抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，得到大豆蛋白酶水解物與常用抗氧化劑抗氧化活性見(jiàn)表1。

表1 大豆蛋白水解物與常用抗氧化劑抗氧化活性的比較

由表1可以看出，大豆蛋白5 h水解物的抗氧化活性與8 h相當(dāng)，而與1 h水解物抗氧化效果差異顯著(P＜0.05)。因此，5 h水解物為最具有抗氧化潛能的多肽。大豆蛋白5 h水解物對(duì)TBARS抑制效果及DPPH自由基清除能力及FRAP值均低于0.01% BHA及0.01%抗壞血酸(P＜0.05)，但與未水解的大豆蛋白和空白相比，其抗氧化效果有明顯優(yōu)勢(shì)(P＜0.05)。

堿性蛋白酶來(lái)源于微生物，是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種蛋白酶，主要成分是一種絲氨酸蛋白酶，具有終端疏水性氨基酸的專(zhuān)一性，主要裂解疏水性氨基酸如:亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等的終端，而疏水性丙氨酸、擷氨酸、亮氨酸的非極性脂肪烴側(cè)鏈能夠加強(qiáng)抗氧化膚與疏水性多不飽和脂肪酸互作，含疏水性氨基酸膚通過(guò)與氧結(jié)合或抑制脂質(zhì)中氫的釋放，延緩脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)，從而保護(hù)脂質(zhì)體系、膜質(zhì)完整性，起到抗氧化作用。如chen等［17］從大豆蛋白酶解物中純化到6個(gè)抗氧化肽，N－端都含疏水性氨基酸;Mendis等［18］從魚(yú)皮明膠中分離到高疏水性抗氧化肽HGPLGP。

抗氧化肽主要是螯合金屬離子、作為供氫體或供電子體清除游離基和促進(jìn)過(guò)氧化物的分解。許多物質(zhì)的抗氧化活性與其具有自由基的清除作用有關(guān)，本研究中隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，即水解程度的加大，大豆多肽清除DPPH自由基的能力增大。相類(lèi)似，Wu等［19］研究也發(fā)現(xiàn)，鯖魚(yú)蛋白由自溶及蛋白酶N所得的水解物清除DPPH自由基能力隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)即水解程度越大，清除能力越強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究以亞鐵還原能力為主要指標(biāo)，以在脂質(zhì)氧化體系中對(duì)TBARS的抑制作用和DPPH自由基清除能力為輔助指標(biāo)，采用堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化的大豆分離蛋白酶解工藝為:底物濃度50 mg/mL，加酶量2%(E/ S)、時(shí)間為5 h、酶解溫度為60℃、pH 8.0。此條件下，酶解物還原能力為823.38 μmol/L，在脂質(zhì)氧化體系中對(duì)TBARS的抑制作用為2.7 mg/L，DPPH自由基清除率為68.47%，水解度為18.56%。

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Antioxidant Effect of Soybean Protein Hydrolysates

Wu Xia1Jiang Lianzhou2Wang Xin2Wang Xirui2
(Chengdong college，Northeast Ariculture University1，Harbin 150030)
(Food College，Northeast Agriculture University2，Harbin 150030)

Soybean protein was hydrolyzed with alcalase in the study.Antioxidant effect of the hydrolysates，including reducing power，inhibition of TBARS，and DPPH radical scavenging activity，was evaluated.Results:The established optimal hydrolysis conditions are substrate concentration=5%，pH=8.0，［E/S］=2%，temperature= 60℃，and hydrolysis time=5 h.The study demonstrates that alcalase hydrolyzed soybean protein can act as a hydrogen donor，as well as a radical stabilizer to inhibit lipid oxidation.

soybean protein，antioxidant activity，alcalase，enzyme hydrolysate

TS214.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003－0174(2010)11－0037－06

863計(jì)劃(2006AA10Z322)

2009－10－20

吳瑕，女，1978年出生，講師，博士，糧食、油脂及植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧食、油脂及植物蛋白工程