喻喜華，陳曉輝，戴榮華，畢開順

(沈陽藥科大學藥學院,遼寧 沈陽 110016)

*陳曉輝，Tel：(024)23986259，E-mail：cxh_syphu@yahoo.com.cn

UPLC測定山茱萸生品與酒炙品中齊墩果酸與熊果酸的含量

喻喜華，陳曉輝*，戴榮華，畢開順

(沈陽藥科大學藥學院,遼寧 沈陽110016)

目的建立山茱萸藥材中齊墩果酸和熊果酸的超高效液相色譜含量測定方法。方法采用超高效液相色譜法，ACQUITY UPLCTMHSS C18色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相：甲醇-0.1%甲酸水(85∶15)，流速：0.2mL·min-1，檢測波長：210nm。結果齊墩果酸和熊果酸分別在0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999)、0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999)與峰面積呈良好的線性關系，平均回收率分別為100.4%、94.4%(n=9)，RSD均為1.8%。結論該方法快速、簡便、準確，可用于山茱萸藥材的質量控制。

山茱萸；超高效液相；齊墩果酸；熊果酸

山茱萸Cornusofficinalis為《中國藥典》收載的常用中藥,其性味酸、澀，微溫。具有補益肝腎，澀精固脫功能。用于眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內熱消渴[1]。山茱萸中主要活性成分齊墩果酸有較強的抗炎、抗病毒、降糖和保肝作用[2]，熊果酸有抗菌消炎、降低血糖的作用,是山茱萸抗糖尿病的有效成分之一[3]。文獻報道的其含量測定方法有薄層掃描法[4]、HPLC-UV[5]、GC[6],還有報道采用HPLC-ELSD[7]對山茱萸中齊墩果酸和熊果酸進行含量測定。齊墩果酸和熊果酸為三萜酸類同分異構體，性質相似。以上分析方法有靈敏度低、干擾大、分析時間長、操作繁瑣等不足。超高效液相色譜法(UPLC法)具有低流速、快速、超高效分離的特點。本研究首次采用UPLC測定山茱萸生品和酒炙品中齊墩果酸與熊果酸的含量,結果表明該方法快速、簡便、準確,可用于山茱萸藥材的質量控制。

1 儀器與試藥

WatersACQUITYUPLCTM：二元泵系統(tǒng)，自動進樣器，2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站；AT200(0.1mg)型電子天平，KQ-250DB型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。齊墩果酸對照品(純度大于98%，購于sigma公司,批號093K0961)，熊果酸對照品(純度大于98%，購于sigma公司,批號042K1240),甲醇、甲酸(色譜純，購于sigma公司)，水(Milli-Q純水處理系統(tǒng)，Millipore)。

山茱萸藥材分別購自安徽、浙江、陜西、河南、遼寧和北京，經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院孫啟時教授鑒定為山茱萸CornusofficinalisSieb. et Zucc.的干燥成熟果肉。將以上藥材粉碎，過篩，取60目以下粉末放入真空干燥箱60℃下干燥24h，取出后放入干燥器內備用。

2 方法與結果

2.1對照品溶液制備

分別稱取齊墩果酸和熊果酸對照品約10mg，精密稱定，用甲醇溶解，定容至10mL，即得。

2.2供試品溶液制備

稱取山茱萸藥材粉末1.0g，精密稱定，置25mL錐形瓶中，加入10mL甲醇，密塞，稱定質量，超聲提取30min,再次稱定質量，用甲醇補充損失的質量，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適用性

ACQUITYUPLCTMHSSC18色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸水(85∶15)；流速：0.2mL·min-1；進樣體積：5μL；檢測波長：210nm；柱溫：30℃。在上述色譜條件下分析，理論塔板數(shù)按齊墩果酸、熊果酸計算均不低于5000，樣品中齊墩果酸、熊果酸與相鄰峰分離度均大于1.5，對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.4線性關系的考察

精密吸取混合對照品溶液0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5mL,分別置5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得標準系列溶液。取齊墩果酸和熊果酸混合對照品系列溶液，在2.3項色譜條件下進樣分析，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算得齊墩果酸回歸方程為Y=1.11×104X+2.14×104，r=0.999 9，熊果酸回歸方程為Y=9.77×103X+3.39×104，r=0.999 9，結果表明齊墩果酸濃度在0.010～0.500mg·mL-1，熊果酸濃度在0.010～0.500mg·mL-1線性范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

2.5精密度試驗

取山茱萸供試液，在2.3項色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算儀器的精密度，得齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為1.24%,0.48%。

2.6重復性試驗

取同一山茱萸粉末6份，每份約1.0g，精密稱定，按2.2項下的方法操作制備供試品溶液，在2.3項色譜條件下進樣分析，測得齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為0.98%,0.75%。

2.7穩(wěn)定性試驗

取山茱萸供試液，于室溫下放置，在2.3項色譜條件下分別于0,2,4,8,12,24h進樣分析，測得齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為0.95%,0.87%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.8回收率試驗

稱取已知含量的山茱萸粉末9份，每份約1.0g，精密稱定，每3份為一組，每組分別精密加入一定量的齊墩果酸、熊果酸對照品。按2.2項下操作制備供試液，在2.3項色譜條件下進樣分析，加樣回收試驗結果見表1～2。

表1 齊墩果酸加樣回收率試驗

表2 熊果酸加樣回收率試驗

2.9樣品測定

分別取不同產(chǎn)地的山茱萸生品和酒炙品粉末約1.0g，精密稱定，按“2.2”項下方法操作制備供試液，在“2.3”項色譜條件下進樣分析，代表性色譜圖見圖1，齊墩果酸和熊果酸的含量測定結果見表3。

圖1 對照品和樣品UPLC圖

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注：n=3

3 討論

本試驗采用了超聲提取法考察甲醇、乙醇的提取效率，結果表明甲醇的提取效率高；在此基礎上考察了超聲提取次數(shù)、提取時間、溶劑用量對實驗結果的影響，結果表明用甲醇超聲提取1次，提取30min即可將山茱萸中的齊墩果酸和熊果酸提取完全。

結果顯示，不同產(chǎn)地山茱萸藥材中齊墩果酸、熊果酸的含量差異不大；而酒炙品較生品中的齊墩果酸和熊果酸的含量略高。炮制是否可提高山茱萸中齊墩果酸和熊果酸的含量，尚需實驗考察。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：26.

[2] 田麗婷,馬龍,堵年生.齊墩果酸的藥理作用研究概況[J].中國中藥雜志,2002,27(12)：884-886.

[3] 楊劍芳,路福平,高文遠,等.山茱萸的化學、藥理及開發(fā)應用研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2006,6(12)：127-133.

[4] 冀春茹,袁珂,胡潤淮,等.冬凌草中熊果酸,齊墩果酸的薄層掃描測定[J].中醫(yī)藥學報,1997,(6)：43-44.

[5] 徐德然,丁晴,王崢濤.HPLC法測定山茱萸及知柏地黃丸中齊墩果酸、熊果酸的含量[J].中草藥,2002,33(11)：996-997.

[6] 閆花麗,趙陸華,朱丹妮,等.衍生化氣相色譜法測定下枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].中國中藥雜志,1999,24(12)：744-746.

[7] 趙永席,馬國營,梁恒.RP-HPLC-ELSD測定山茱萸中齊墩果酸與熊果酸的含量[J].中成藥，2005，27(11)：1314-1316.

DeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidinCrudeandProcessedFructusCornibyUPLC

Yu Xihua, Chen Xiaohui, Dai Ronghua, Bi Kaishun

(SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,ShenyangLiaoning110016,China)

Objective: To develop a method for the determination of the contents of oleanolic acid and ursolic acid in crude and processed Fructus Corni by UPLC.MethodsAn ACQUITY UPLCTMHSS C18column (2.1mm×100mm，1.8μm) was used with methanol-0.1% formic acid water (85∶15) as the mobile phase .The flow rate was0.2mL·min-1and the detection wavelength was210nm.ResultsThe calibration curve showed good linearity relationships in the ranges of0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999) and0.010～0.500mg·mL-1(r=0.9999) for oleanolic acid and ursolic acid, respectively. Average recoveries of oleanolic acid and ursolic acid were100.4% with RSD=1.8% (n=9) and94.4% with RSD=1.8%(n=9), respectively.ConclusionThis method was simple, fast, accurate and reproducible, which was suitable for the quality control of Fructus Corni.

Fructus Corni; UPLC; Oleanolic Acid; Ursolic Acid

2010-03-16)