農(nóng)衛(wèi)良，管驍，徐斐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

采用微量熱法快速檢測(cè)食品中的細(xì)菌總數(shù)*

農(nóng)衛(wèi)良，管驍，徐斐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

以醬牛肉中的污染菌為測(cè)試菌，利用微量熱儀測(cè)定了細(xì)菌的生長(zhǎng)熱譜曲線。結(jié)果表明，選擇24 h的菌體活化時(shí)間，并在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后計(jì)算菌體生長(zhǎng)熱效應(yīng)值，在103～106CFU/mL范圍內(nèi)菌體放熱量能較好地反映細(xì)菌總數(shù)值，且微量熱法測(cè)得結(jié)果與常規(guī)平板計(jì)數(shù)法無(wú)顯著差異。

微量熱法，細(xì)菌總數(shù)，快速檢測(cè)

對(duì)食品中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行快速測(cè)定是現(xiàn)代食品衛(wèi)生控制工作中的一項(xiàng)重要任務(wù)［1］。近年來(lái)，隨著諸如酶聯(lián)免疫吸附分析、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、微量熱法等新技術(shù)的開(kāi)發(fā)成功［2－3］，為細(xì)菌總數(shù)的快速定量提供了多種可能。這些快檢技術(shù)原理各不相同，適用范圍也存在差異。其中微量熱法具有通用性強(qiáng)，適用于所有微生物檢測(cè)等特點(diǎn)，備受食品工作者的關(guān)注［4］。微量熱法快速檢測(cè)微生物是利用微生物生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生熱效應(yīng)的原理設(shè)計(jì)而成的，微生物在生長(zhǎng)和代謝的過(guò)程中，能產(chǎn)生一定的代謝熱，且熱效應(yīng)與微生物的數(shù)量呈比例關(guān)系。然而目前此法的發(fā)展也受到一些因素的限制，如微生物生長(zhǎng)熱效應(yīng)過(guò)程周期長(zhǎng)、熱信號(hào)小等，因而對(duì)熱量值進(jìn)行定量往往誤差較大。若能有效放大微生物的熱信號(hào)值，將對(duì)采用微量熱法對(duì)微生物進(jìn)行快速定量具有重要意義。前期試驗(yàn)已對(duì)量熱用細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定微生物生長(zhǎng)熱來(lái)表征初始細(xì)菌總數(shù)，并將微量熱法測(cè)定結(jié)果與常規(guī)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，以期驗(yàn)證微量熱法在細(xì)菌快速定量中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

菌種:來(lái)自于醬牛肉中的優(yōu)勢(shì)菌株，本實(shí)驗(yàn)室自行分離純化;細(xì)菌混懸液是按照醬牛肉樣品中各種細(xì)菌的平均比例進(jìn)行混懸。

NaCl、葡萄糖、MaSO4均為分析純?cè)噭?，胰蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑?/p>

1.1.2 儀器與設(shè)備

Micro DSCⅢ型微量熱儀，法國(guó)SETARAM公司，蠕動(dòng)泵BT00－300M:常州市城合衛(wèi)生設(shè)備廠。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

普通培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉浸膏3 g溶于1 000mL蒸餾水中，調(diào)pH值至6.8～7.2，121℃高壓滅菌20 min備用。

優(yōu)化培養(yǎng)基:胰蛋白胨8.45 g、NaCl 5 g、MgSO40.2 g、酵母浸膏4.5 g、葡萄糖1.42 g溶于1 000mL蒸餾水，調(diào)pH值至7.2，121℃高壓滅菌20 min備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 量熱測(cè)定［5－6］

量熱實(shí)驗(yàn)在微量熱儀Micro DSC III上進(jìn)行，采用停流法。首先對(duì)循環(huán)池及管路進(jìn)行清洗消毒，清洗過(guò)程為:先以30mL/h流速的無(wú)菌蒸餾水清洗30 min，再用75%乙醇以相同流速清洗30 min，最后用無(wú)菌蒸餾水再?zèng)_洗30 min。待基線平穩(wěn)后，以30mL/h的流速泵入接過(guò)菌種的細(xì)菌培養(yǎng)液，確認(rèn)培養(yǎng)液已充滿(mǎn)流動(dòng)池后停泵，儀器即開(kāi)始測(cè)量記錄循環(huán)池內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的熱功率－時(shí)間曲線。測(cè)量過(guò)程完成后，對(duì)該生長(zhǎng)熱曲線進(jìn)行積分計(jì)算出細(xì)菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程的累積放熱量 Q［4，7］。

1.2.2 細(xì)菌活化時(shí)間對(duì)放熱的影響

冷藏菌種的活化在普通培養(yǎng)基倒成的平板上進(jìn)行。在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，改變量熱實(shí)驗(yàn)前細(xì)菌的活化時(shí)間(分別為12、24、36和48 h)，然后在接種相等菌量的條件下進(jìn)行量熱實(shí)驗(yàn)，比較細(xì)菌前期活化時(shí)間對(duì)其生長(zhǎng)放熱量的影響。

1.2.3 初始細(xì)菌總數(shù)和放熱量Q的關(guān)系

其他條件相同情況下，考察不同初始細(xì)菌接種量分別在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間(4、5、6、7 h)(即對(duì)應(yīng)熱譜曲線中不同的積分時(shí)間)和累積放熱量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的最佳測(cè)熱條件，對(duì)不同細(xì)菌總數(shù)的菌懸液(1 000～100 0000 CFU/mL)進(jìn)行熱量值測(cè)定，建立“熱量值－細(xì)菌總數(shù)”的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 確證實(shí)驗(yàn)

制取未知菌液濃度的菌懸液，分成2份，1份利用量熱法檢測(cè)未知濃度菌懸液4 h的放熱量，并通過(guò)細(xì)菌放熱標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到細(xì)菌總數(shù)。另1份用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)。對(duì)2種方法的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)細(xì)菌放熱的影響

量熱過(guò)程中所使用培養(yǎng)基的不同會(huì)直接影響到細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)熱效應(yīng)產(chǎn)生影響。通過(guò)量熱實(shí)驗(yàn)分別得到細(xì)菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)熱譜圖，如圖1所示。

圖1 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)放熱圖譜

從圖1可以看出，細(xì)菌在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，雖有熱效應(yīng)峰出現(xiàn)，但峰形不夠明顯且不規(guī)則，而細(xì)菌在優(yōu)化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出現(xiàn)了典型的特征性放熱峰，且比較好地反映出了細(xì)菌生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期，這可能是由于菌體在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況不同而造成生長(zhǎng)熱效應(yīng)有差異引起的［4，8－9］。通過(guò)對(duì)熱譜曲線不同時(shí)間段的積分，可以求得細(xì)菌生長(zhǎng)不同時(shí)期所產(chǎn)生的累積熱效應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)熱效應(yīng)不如在優(yōu)化培養(yǎng)基中的顯著，且累積熱效應(yīng)與放熱時(shí)間的關(guān)系呈先增加(5 h之前)后減小的變化趨勢(shì)，這可能是由于細(xì)菌在生長(zhǎng)初期正常生長(zhǎng)放熱，到后期出現(xiàn)菌體自溶吸熱所造成的［10］。相比之下，菌體在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)熱效應(yīng)較大，且在7 h的測(cè)熱過(guò)程中持續(xù)放熱，熱效應(yīng)與放熱時(shí)間呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，由此說(shuō)明優(yōu)化培養(yǎng)基更有利于在微量熱法測(cè)定過(guò)程中的應(yīng)用。

圖2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)熱效應(yīng)的比較

2.2 細(xì)菌前期活化時(shí)間對(duì)其生長(zhǎng)放熱的影響

細(xì)菌活化過(guò)程即細(xì)菌恢復(fù)性培養(yǎng)，該過(guò)程可使細(xì)菌恢復(fù)至良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，這對(duì)后面的量熱實(shí)驗(yàn)成敗至關(guān)重要。低溫長(zhǎng)時(shí)間保藏的菌種生理上處于休眠期，因此在量熱實(shí)驗(yàn)前需對(duì)其進(jìn)行活化，從而將細(xì)菌開(kāi)始放熱時(shí)間提前，并增大累積熱信號(hào)值。活化時(shí)間的長(zhǎng)短與活化效果緊密相關(guān)。不同活化時(shí)間對(duì)量熱實(shí)驗(yàn)的影響如圖3所示。從圖3可見(jiàn)，細(xì)菌活化24 h后放熱狀態(tài)達(dá)到最佳，出現(xiàn)特征性雙峰，重現(xiàn)性高。而活化12 h細(xì)菌在平板中的生長(zhǎng)情況不佳，活性不足，未能出現(xiàn)預(yù)計(jì)的放熱峰，但在4～5 h波動(dòng)較大，說(shuō)明在此區(qū)間已處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但放熱不均勻，波動(dòng)大;活化時(shí)間為36、48 h的細(xì)菌在制成的菌懸液中出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，不易溶解。雖活化時(shí)間為36 h的細(xì)菌出現(xiàn)放熱峰，但已處于生長(zhǎng)末期，放熱量少?；罨?6 h和48 h的細(xì)菌放熱曲線無(wú)明顯規(guī)律，未出現(xiàn)特征性雙峰，且重現(xiàn)性低，可能是活化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致大部分細(xì)菌衰退死亡和分解代謝出一些不利于細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，影響細(xì)菌生長(zhǎng)放熱［11－13］。

2.3 初始細(xì)菌總數(shù)與放熱量的關(guān)系

要將微量熱法成功應(yīng)用于食品中細(xì)菌的快速定量檢測(cè)，應(yīng)能保證使菌體在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較大的熱響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)中比較了不同數(shù)量的細(xì)菌生長(zhǎng)不同時(shí)間后所產(chǎn)生的熱效應(yīng)，結(jié)果如圖4、圖5所示。從圖4中可看出，隨著測(cè)熱時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體累積熱效應(yīng)越大，生長(zhǎng)5 h的放熱量明顯高于4 h，這可能是由于5 h前菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)活動(dòng)旺盛;5 h后放熱量增幅越來(lái)越小，說(shuō)明菌體可能處于穩(wěn)定期和衰亡期，這一點(diǎn)從熱譜圖(圖3.b)中也可以看出來(lái)。由圖5可知，對(duì)不同初始菌量的菌體而言，測(cè)定其4 h或5 h的累積熱效應(yīng)值與細(xì)菌總數(shù)間呈現(xiàn)了較好的線性關(guān)系，特別是4 h的放熱量與細(xì)菌總數(shù)之間的線性關(guān)系R2值可達(dá)0.966 1。這間接印證了該時(shí)期菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定，熱效應(yīng)持續(xù);而測(cè)量6 h或7 h的熱量值，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌總數(shù)和熱效應(yīng)間已無(wú)明顯的變化規(guī)律，這可能是由于此時(shí)的熱效應(yīng)不僅包括菌體的生長(zhǎng)熱，還包括菌體自溶、菌體代謝產(chǎn)物對(duì)自身的抑制作用等其他影響因素。在每次試驗(yàn)結(jié)束后，取出菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，得到細(xì)菌在循環(huán)池內(nèi)4～7 h的生長(zhǎng)情況，結(jié)果也證明細(xì)菌在4～7 h內(nèi)菌數(shù)增長(zhǎng)緩慢，甚至減少。其原因可能是循環(huán)池內(nèi)培養(yǎng)基中氧氣耗盡與菌體生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制作用導(dǎo)致的。因此，選擇測(cè)熱時(shí)間為4 h能較好體現(xiàn)細(xì)菌總數(shù)與放熱量的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖3 不同活化時(shí)間的細(xì)菌生長(zhǎng)熱譜圖

圖4 測(cè)熱時(shí)間與放熱量的關(guān)系

圖5 不同細(xì)菌總數(shù)與放熱量的關(guān)系

2.4 放熱標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)以上對(duì)測(cè)熱條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選擇細(xì)菌活化時(shí)間24小時(shí)，然后將菌體接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中導(dǎo)入微量熱儀循環(huán)池，測(cè)定菌體4 h內(nèi)的生長(zhǎng)熱效應(yīng)，并將熱量值與初始細(xì)菌總數(shù)一一對(duì)應(yīng)，即得到細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。處理結(jié)果表明:若對(duì)該曲線進(jìn)行二次回歸擬合，得到的二次回歸曲線y=－7.8×10－7x2+0.001 3x+0.100 8(r2=0.942 4)的擬合關(guān)系并不好;若作一段式線性擬合y=0.000 9x+0.114 1(r2=0.936 1)，擬合關(guān)系也不佳;但對(duì)該曲線進(jìn)行分段線性擬合，如圖6所示，AB段的擬合曲線為y=0.003 6x+0.043 6(r2=0.969 6)，BC段的為y=0.000 8x+0.180 8(r2=0.986 6)，由此可見(jiàn)分段線性擬合后各段之間的線性關(guān)系良好，因此可根據(jù)其放熱量并采用分段標(biāo)準(zhǔn)曲線處理方式來(lái)計(jì)算對(duì)應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)。

圖6 初始菌數(shù)與放熱量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

利用微量熱法對(duì)2份未知濃度的菌懸液進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法結(jié)果比對(duì)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，2種測(cè)定方法所得結(jié)果之間的誤差小于10%(分別為7.76%和9.78%)，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果表明該差異不顯著，由此說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。特別值得指出的是，該標(biāo)準(zhǔn)曲線提供了103～106CFU/mL范圍內(nèi)的初始菌量的熱量值，可以滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)際食品樣品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)要求。但若細(xì)菌總數(shù)更小，由于能檢測(cè)到的熱信號(hào)較小，并易受到周?chē)h(huán)境和儀器精度等因素的影響，應(yīng)該考慮通過(guò)其他方式將其熱信號(hào)進(jìn)一步放大才能滿(mǎn)足檢測(cè)的要求，這有待于進(jìn)一步的研究。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在已篩選得到醬牛肉優(yōu)勢(shì)菌的基礎(chǔ)上，對(duì)牛肉中的細(xì)菌總數(shù)微量熱法快速測(cè)定實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件可用于細(xì)菌總數(shù)的實(shí)測(cè)，并與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，細(xì)菌活化時(shí)間、測(cè)熱培養(yǎng)基的選擇及測(cè)熱時(shí)間長(zhǎng)短均對(duì)量熱法測(cè)定結(jié)果影響顯著，選擇24 h的菌體活化時(shí)間，并在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h后計(jì)算菌體生長(zhǎng)熱效應(yīng)值，在103～106CFU/mL范圍內(nèi)能較好地反映細(xì)菌總數(shù)值;且微量熱法所得結(jié)果與常規(guī)平板計(jì)數(shù)法基本相符;重要的是，微量熱法能大大減少檢測(cè)時(shí)間，由常規(guī)的48 h減少為4 h。

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Study on Rapid Detection Method of the Microbial Biomass in Food by Microcalorimetry

Nong Wei-liang，Guan Xiao，Xu Fei
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

In this paper，the thermogram with respect to the growth of bacteria in beef was determined with microcalorimeter.The results indicated that the total amount of bacteria could be calculated by thermal effect of bacteria growth in the range of 103～106CFU/mL under the condition of active time 24 h and incubation for 4 h in optical culture.And there was no significant difference between the results obtained by the method of microcalorimetry and platecount.

microcalorimetry，microbial biomass，rapid detection

碩士研究生(徐斐教授為通訊作者)。

*上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目(08ZZ77)，上海市研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(JWCXSL0902)，上海高校選撥培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專(zhuān)項(xiàng)基金(slg－07047)

2010－01－25，改回日期:2010－08－23