李丹，趙新淮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150030)

酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產(chǎn)物的金屬離子螯合能力*

李丹，趙新淮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150030)

利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)對(duì)酪蛋白進(jìn)行限制性脫酰胺和水解處理，以SDS-PAGE及排阻色譜分析評(píng)價(jià)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)降解情況，并制備具有較低脫酰胺度的脫酰胺酪蛋白產(chǎn)物。在酪蛋白質(zhì)量濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37℃的條件下分別反應(yīng)6 h、12 h和24 h，制得脫酰胺度分別為2.8%、5.8%和8.5%，水解度分別為2.5%、3.4%和4.9%的脫酰胺酪蛋白。評(píng)價(jià)這3種脫酰胺酪蛋白產(chǎn)物對(duì)Fe2+和Ca2+的螯合能力，結(jié)果表明，脫酰胺酪蛋白產(chǎn)物對(duì)Fe2+和Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，并隨著脫酰胺度的增加而提高。

谷氨酰胺酶，酪蛋白，脫酰胺，螯合能力，鐵，鈣

食品蛋白質(zhì)經(jīng)過特定的修飾會(huì)改變其相應(yīng)性質(zhì)，如酶法水解既能獲得具有生物活性的肽［1］，又可提高食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)［2］。酶處理方法的反應(yīng)條件相對(duì)溫和，一般不會(huì)導(dǎo)致有毒物質(zhì)的產(chǎn)生。食品蛋白質(zhì)經(jīng)過脫酰胺作用后，能夠改善一些功能性質(zhì)，因此具有潛在的食品加工應(yīng)用價(jià)值［3］。例如，燕麥分離蛋白經(jīng)脫酰胺處理后溶解性、乳化性等功能性質(zhì)均有顯著增強(qiáng)［4］。對(duì)小麥蛋白進(jìn)行脫酰胺作用，結(jié)果表明，中性pH條件下脫酰胺小麥蛋白的溶解性及乳化性質(zhì)有顯著的提高［5］。另外，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物對(duì)一些礦物質(zhì)元素(如Fe2+和Ca2+)有較好的螯合作用，可以作為配體來提高礦物質(zhì)的溶解性，提高礦物質(zhì)的生物利用率［6］。Kumagai等［7］發(fā)現(xiàn)，去肌醇六磷酸大豆球蛋白經(jīng)脫酰胺后對(duì)Ca2+的螯合能力，相比大豆球蛋白以及去肌醇六磷酸大豆球蛋白對(duì)Ca2+的螯合能力都有所增強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，即使經(jīng)消化酶作用后，去肌醇六磷酸脫酰胺大豆球蛋白仍具有較高的Ca2+螯合能力，并且脫酰胺大豆球蛋白及其水解產(chǎn)物顯著提高小腸對(duì)Ca2+的吸收利用率［8］。

本研究利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)對(duì)酪蛋白進(jìn)行限制性脫酰胺，得到較低脫酰胺度或水解度的脫酰胺產(chǎn)物，并對(duì)其Fe2+和Ca2+螯合能力進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(蛋白質(zhì)含量93.8%)、3-(2-吡啶基)-5，6-雙(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(ferrozine)、谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)，均購自Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，購自索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;Kjeltec TM 3200全自動(dòng)凱式定氮儀，瑞士Foss公司;UVP/C8484－05G凝膠成像分析系統(tǒng)，美國UVP公司;AKTA100蛋白純化儀，美國GE Amersham公司;AA－800原子吸收分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的限制性酶解

配制質(zhì)量濃度為10%酪蛋白溶液，并用0.2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。配制0.01 g/mL谷氨酰胺酶溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，將一定量的酪蛋白溶液與超純水、不同體積的谷氨酰胺酶溶液混合，配制成酪蛋白質(zhì)量濃度為5%、酶添加量分別為100、400、700 U/kg酪蛋白的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系在37℃下酶解6～36 h，按照以下方法分別測定產(chǎn)物的脫酰胺度及水解度。以未加谷氨酰胺酶溶液的酪蛋白溶液為空白。

1.3.2 相關(guān)分析

1.3.2.1 蛋白質(zhì)含量、脫酰胺度以及水解度的測定

(1)蛋白質(zhì)含量:凱氏定氮法［9］。

(2)脫酰胺度測定:苯酚-次氯酸鹽法［10］。

反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液2mL置于離心管中，并立即加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的三氯乙酸終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min除去沉淀，上清液待測。

試劑A:分取5.0 g苯酚、25 mg亞硝基鐵氰化鈉，溶于雙蒸水中，定容至500mL。

試劑B:取2.5 g NaOH溶于雙蒸水中，加入4.2mL的質(zhì)量濃度為6.5%的次氯酸鈉溶液，定容至500mL。試劑A和試劑B均置于棕色試劑瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

移取5.0mL試劑A于試管中，加入20μL樣品溶液(或20μL雙蒸水)，充分振蕩、混勻。移取5.0mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻。37℃水浴中反應(yīng)20 min，冷卻至室溫，并在625 nm波長測定溶液吸光值a(或b)。以硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2～1μg/μL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;根據(jù)所得差值(ab)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中游離氨濃度。

稱取一定量的酪蛋白，置入水解管，然后加入5mL終濃度為3mol/L的H2SO4，用酒精噴燈密封水解管，110℃下水解24 h。水解完畢后，將水解液中和至中性并稀釋一定倍數(shù)后，按上述方法，在625 nm波長測定水解液稀釋液的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出酪蛋白中谷氨酰胺和天冬酰胺殘基總量。脫酰胺度計(jì)算公式如式(1):

(3)蛋白質(zhì)水解度的測定:鄰苯二甲醛(OPA)法［11］。

OPA試劑:取2.00 g十二烷基磺酸鈉(SDS)，加入一定量硼酸緩沖溶液(pH 9.5)，待完全溶解后，加入 1mL 80mg/mL 的 OPA 乙醇溶液、200μL β-巰基乙醇，最后用硼酸緩沖溶液定容至100mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

將樣品溶液稀釋至一定倍數(shù)后，取3mL樣品稀釋液與同體積OPA試劑混合并開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，立即在分光光度計(jì)上340 nm波長處測吸光值。以亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(12～36μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中游離氨基濃度(μmol/mL)。水解度計(jì)算公式如式(2):

1.3.2.2 SDS-PAGE分析

采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為15%。濃縮膠和分離膠配此組成見表1［12］。凝膠板面積120 mm×100 mm，凝膠厚度1.5 mm，上樣量10μL。電泳時(shí)初始電壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)電壓增至120V;當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠板底部時(shí)，停止電泳。剝離凝膠，加入戊二醛固定液固定1 h。取出固定好的凝膠在染色液(含0.25%考馬斯亮藍(lán)R250、45%甲醇、10%乙酸)中染色3～5 h，棄去染色液，加入脫色液［V(甲醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=2∶2∶9］，經(jīng)常更換脫色液，直至凝膠的藍(lán)色背景褪去，蛋白質(zhì)色帶清晰為止。然后于凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)各條帶進(jìn)行分析。

表1 SDS-PAGE電泳分析時(shí)凝膠的配制

1.3.2.3 排阻色譜分析

采用Chu等人［13］的方法，略有改動(dòng)。將酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白產(chǎn)物溶于0.2mol/L、pH值12的磷酸鹽緩沖溶液中，終濃度為2mg/mL;洗脫劑為0.2mol/L、pH值12的磷酸鹽緩沖溶液。樣品溶液和洗脫劑通過0.45 μm微孔濾膜過濾，并用超聲波脫氣。利用美國GE Amersham公司AKTA蛋白純化儀進(jìn)行測定。柱子型號(hào)為10 mm×300 mm、填料為Pharmacia Superdex－75凝膠。上樣量為0.5mL，壓力1.80 MPa，洗脫速度0.5mL/min。蛋白質(zhì)檢測波長280 nm。每次進(jìn)樣前用洗脫流動(dòng)相沖洗進(jìn)樣環(huán)。

1.3.2.4 Fe2+螯合能力測定

采用 Xu等人［14］的方法，稍有改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取250μL 1mg/mL的樣品溶液(樣品最終濃度為100μg/mL)直接與 XμL 1 mmol/L的 FeCl2溶液混合(最終濃度為10～60 μmol/L，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配)，加入一定量的超純水使反應(yīng)體系終體積為1.5mL?；靹蚝蠓胖? min，再加入1mL 500 μmol/L的Ferrozine水溶液(終濃度為200 μmol/L)，充分振蕩、混勻?；旌象w系在室溫下靜置10 min，使充分反應(yīng)形成Fe2+-Ferrozine復(fù)合物，用紫外分光光度法在562 nm條件下測吸光值。對(duì)照樣中加入一定量的EDTA溶液(終濃度為10 μmol/L)。整個(gè)過程中，使用的水為超純水。樣品對(duì)Fe2+的螯合效率計(jì)算見公式(3):

式中:AT，樣品吸光度;AC，對(duì)照樣吸光度［XμL 1 mmol/L的FeCl2溶液加入(2 500－X)μL超純水］。

1.3.2.5 Ca2+螯合能力的測定

采用Bao等人［15］的方法，略有改動(dòng)。

(1)將0.03 g樣品溶解于3mL、pH7.4的 Tris-HCl緩沖溶液，37℃水浴中放置10 min，充分溶解后加入0.04mol/L的CaCl2溶液1mL。37℃水浴中反應(yīng)30 min后，6 000 r/min離心5 min，收集上清液。將上清液稀釋至一定倍數(shù)，用原子吸收光譜法測定上清液中的Ca2+含量A。Ca2+螯合能力計(jì)算公式為:

式中:AT，總Ca2+的量(mol);A，上清液中 Ca2+的量(mol);P，蛋白質(zhì)質(zhì)量(g)。

(2)鈣含量測定:采用空氣-乙炔火焰原子吸收光譜法(FAAS法)。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的硝酸溶液將Ca2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)逐級(jí)稀釋成0、2、4、6、8、10μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定條件為:波長422.7 nm，燈電流8 mA，狹縫0.7 nm，乙炔流量1 L/min，空氣流量4.0 L/min，燃燒器高度10 mm。測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(濃度由低到高)的Ca2+含量，儀器自動(dòng)處理數(shù)據(jù)，并顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線。確認(rèn)后，按順序進(jìn)行空白和樣品溶液的測定。計(jì)算機(jī)給出測定結(jié)果［10］。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，采用Excel 2003軟件繪制圖示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白的脫酰胺反應(yīng)條件及水解度

研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白的脫酰胺作用隨酶添加量的增加而增加(如圖1所示)。在37℃條件下，初始反應(yīng)階段(0～18 h)，酪蛋白的脫酰胺度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而顯著增加;反應(yīng)24 h以后，酪蛋白的脫酰胺度幾乎沒有顯著增加。因此，反應(yīng)24 h足可以完成酪蛋白的脫酰胺反應(yīng)。對(duì)比酶添加量的影響，發(fā)現(xiàn)脫酰胺度隨著酶添加量的增加而大幅度增加。酶添加量為100 U/kg酪蛋白或者400 U/kg酪蛋白時(shí)，酪蛋白的脫酰胺度比酶添加量為700 U/kg酪蛋白的脫酰胺度低。反應(yīng)24 h時(shí)，酶添加量分別為100、400、700 U/kg酪蛋白時(shí)，酪蛋白的脫酰胺度分別為3.9、8.5、10.2%?？紤]到反應(yīng)效率、酶成本等因素，在以后研究中酶添加量選用400 U/kg酪蛋白。

圖1 反應(yīng)時(shí)間和酶添加量對(duì)酪蛋白脫酰胺的影響(n=3)

酪蛋白的脫酰胺度還與反應(yīng)溫度有關(guān)(如圖2)，可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，酶添加量為400 U/kg酪蛋白時(shí)，32、37和42℃進(jìn)行的脫酰胺反應(yīng)，只有37℃下脫酰胺度最高，說明谷氨酰胺酶在37℃下的脫酰胺活力最高。因此，可以初步確定，酪蛋白脫酰胺反應(yīng)的適宜反應(yīng)條件為質(zhì)量濃度為5%的酪蛋白溶液、反應(yīng)溫度37℃、酶添加量400 U/kg酪蛋白。此條件下，當(dāng)反應(yīng)分別進(jìn)行6、12、24 h時(shí)，酪蛋白的脫酰胺度分別為2.8%、5.8%、8.5%，相應(yīng)的水解度分別為2.5%、2.4%、4.9%，這些產(chǎn)物是具有較低脫酰胺度的水解酪蛋白，在以后的研究中分別稱為脫酰胺酪蛋白 1、2、3。

圖2 溫度對(duì)酪蛋白脫酰胺反應(yīng)的影響(n=3)

2.2 SDS-PAGE及排阻色譜分析

通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，與酪蛋白相比，3種脫酰胺酪蛋白在分子質(zhì)量為31.0 ku附近的肽段幾乎完全被水解(如圖3所示)，即谷氨酰胺酶使酪蛋白幾乎完全水解成小肽。小分子質(zhì)量的肽主要分布在20.1、14.4 ku附近以及14.4 ku以下，并且隨著脫酰胺反應(yīng)時(shí)間的延長，小分子質(zhì)量的肽段更多。這再次說明谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白除了具有脫酰胺作用外，還有一定的水解作用。

圖3 酪蛋白與脫酰胺酪蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

酪蛋白與2個(gè)脫酰胺酪蛋白的排阻色譜分析結(jié)果如圖4所示。從分析結(jié)果上看，2個(gè)脫酰胺蛋白的峰形與酪蛋白的峰形差異顯著，說明酪蛋白在脫酰胺過程中幾乎被完全水解并生成分子質(zhì)量更小(洗脫時(shí)間更長)的產(chǎn)物。這一結(jié)果也證明了SDS-PAGE分析結(jié)果，即谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白具有水解作用。

圖4 酪蛋白與脫酰胺酪蛋白排阻色譜分析結(jié)果

2.3 酪蛋白及其脫酰胺酪蛋白對(duì)Fe2+、Ca2+的螯合能力

以EDTA為對(duì)照樣，向EDTA、酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白溶液中加入10～60 μmol/L的Fe2+，考察它們對(duì)Fe2+的螯合能力，結(jié)果如圖5A所示。脫酰胺酪蛋白對(duì)Fe2+螯合的能力比酪蛋白、10 μmol/L的EDTA的更強(qiáng)(尤其是在較高Fe2+添加量)，整體上約增加50%～400%，并且脫酰胺酪蛋白螯合Fe2+的能力大小依次為脫酰胺酪蛋白3、脫酰胺酪蛋白2、脫酰胺酪蛋白1。圖5B為酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白對(duì)Ca2+的螯合能力測定結(jié)果。脫酰胺酪蛋白1、脫酰胺酪蛋白2以及脫酰胺酪蛋白3的Ca2+螯合能力分別為 1.23、1.41、1.49 mmol/g，而酪蛋白為 1.05 mmol/g，即脫酰胺酪蛋白對(duì)Ca2+的螯合能力也是隨著脫酰胺度的增加而增強(qiáng)，并且都高于酪蛋白。這些結(jié)果表明，脫酰胺過程中酪蛋白的谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)換成谷氨酸殘基，因此，更多的Fe2+或Ca2+結(jié)合于脫酰胺酪蛋白。理論上，酪蛋白中谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)換成谷氨酸殘基的數(shù)量越多(即脫酰胺度越高)，螯合Fe2+或Ca2+的能力就越強(qiáng)。

圖5 酪蛋白與脫酰胺酪蛋白對(duì)Fe2+和Ca2+的螯合能力

食品蛋白質(zhì)具有螯合金屬離子的能力，蛋白質(zhì)對(duì)Ca2+和Fe2+的螯合能力越強(qiáng)，越能夠提高元素的生物利用率，有利于機(jī)體對(duì)礦物質(zhì)元素的吸收利用率。此外，F(xiàn)e2+和Cu2+能夠催化反應(yīng)形成氧自由基，對(duì)Fe2+和Cu2+的螯合能力越強(qiáng)，則蛋白質(zhì)的抗氧化能力就越強(qiáng)。綜上所述，脫酰胺酪蛋白可以作為一種很好的蛋白質(zhì)基料，并在食品加工中具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)對(duì)酪蛋白具有脫酰胺和肽鍵水解作用能力。在酪蛋白質(zhì)量濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37℃的最佳反應(yīng)條件下，分別反應(yīng)6、12、24h制得3種脫酰胺酪蛋白，其脫酰胺度分別為2.8%、5.8%、8.5%，水解度分別為2.5%、3.4%、4.9%。SDS-PAGE以及排阻色譜分析結(jié)果證明，谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白具有水解作用。分析結(jié)果表明，脫酰胺酪蛋白對(duì)Fe2+及Ca2+的螯合能力均高于酪蛋白，且螯合能力與脫酰胺度相關(guān)。

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Hydrolysis of Casein by Glutaminase and Metal Chelating Activity of the Prepared Products

Li Dan，Zhao Xin-huai
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Glutaminase(EC 3.5.1.2)was applied in the present work to treat casein for deamidation and hydrolysis to a limited reaction extent.SDS-PAGE and size exclusion chromatography analysis were used to evaluate the degradation of casein.Some deamidated casein products with lower degree of deamidation were prepared with reaction conditions of casein concentration of 5%(w/v)，glutaminase addition level of 400 U/kg casein，reaction temperature of 37℃ and reaction time were 6，12 and 24 h，respectively.Three deamidated casein products prepared had the degree of deamidation of 2.8%，5.8%and 8.5%，or degree of hydrolysis of 2.5%，3.4%and 4.9%，respectively，were prepared.The iron or calcium(II)chelating activities of three deamidated caseind products were analyzed.The results indicated that the iron or calcium(II)chelating activities of three deamidated casein products were higher than that of casein，and would be enhanced as degree of deamidation increased.

glutaminase，casein，deamidation，chelating activity，iron，calcium

博士研究生(趙新淮教授為通訊作者)。

*黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2010td11)和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(CXT007－1－1)。

2010－06－18，改回日期:2010－07－25