崔志峰，沈情佳，汪琨，朱廷恒

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州，310032)

釀酒酵母CWY132以糖蜜為碳源生產(chǎn)2-苯乙醇的培養(yǎng)條件*

崔志峰，沈情佳，汪琨，朱廷恒

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州，310032)

對釀酒酵母CWY132利用糖蜜為碳源，生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成2-苯乙醇的液-液兩相分批補料培養(yǎng)工藝進行了研究。發(fā)現(xiàn)在以聚丙二醇(PPG1500)作為抽提劑的液-液兩相培養(yǎng)中，采用分批補料方式添加糖蜜和L-Phe使2-苯乙醇產(chǎn)量明顯提高。在0、4、8、12、24 h分別添加40g/L糖蜜，4、8 h分別添加12g/L、3g/L L-Phe的液-液兩相分批補料培養(yǎng)中，2-苯乙醇產(chǎn)量最高達到9.03g/L，其中抽提相中2-苯乙醇濃度22.5g/L，比優(yōu)化前的液-液兩相單批培養(yǎng)中的產(chǎn)量4.82g/L提高了87%。底物L-Phe的摩爾轉(zhuǎn)化率達到0.82 mol/mol。

釀酒酵母，2-苯乙醇，糖蜜，分批補料

2-苯乙醇(2-phenylethanol，PEA) 是一種具有柔和細膩玫瑰氣味的芳香醇，大量應用于玫瑰型及其他類型的香精配方中，在食品和日化用品等領(lǐng)域中也有廣泛應用。天然2-苯乙醇一般從玫瑰等植物精油中提取，但由于原料來源和提取成本等原因而難以滿足市場需求。生物技術(shù)的發(fā)展為天然2-苯乙醇的生產(chǎn)提供了新的途徑，用酵母生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然2-苯乙醇周期短、原料便宜，具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛在能力。

Etschmann等首次報道了酵母用糖蜜作為碳源產(chǎn)2-苯乙醇，并利用油醇(oleyl alcohol)/水兩相體系使2-苯乙醇產(chǎn)量大幅提高［1－2］。糖蜜作為制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，含有豐富的可發(fā)酵糖和微量元素等其他營養(yǎng)成分，并具有廉價、易得等優(yōu)點。在前期研究中，課題組發(fā)現(xiàn)實驗室保存的釀酒酵母CWY132利用糖蜜作為碳源時的2-苯乙醇產(chǎn)量僅次于葡萄糖，而高于其他的碳源(蔗糖、麥芽糖、果糖、木糖)［3］。本課題組首先考察幾種由不同的有機溶劑萃取劑組成的有機溶劑/水兩相體系，重點研究了釀酒酵母CWY132在液-液兩相體系中以糖蜜為碳源生產(chǎn)2-苯乙醇的生物轉(zhuǎn)化過程特性。

1 材料和方法

1.1 菌株

高產(chǎn)酵母菌株CWY132，由S.cerevisiae AS 2.516通過紫外誘變得到(本實驗室保存，專利號200710066884.0)。

1.2 培養(yǎng)基

固體瓊脂培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母提取物10，瓊脂20，腺嘌呤0.04，pH 6.0～6.5。

液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母提取物10，腺嘌呤0.04，pH 6.0～6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜60(或葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、木糖分別 30)，MgSO40.5，KH2PO45，K2HPO42，酵母氮堿 0.17，L-Phe 5.8(通過過濾滅菌)，pH值5.0。裝液量為50mL/500mL搖瓶。

1.3 培養(yǎng)方法

單相培養(yǎng):從固體瓊脂培養(yǎng)基上挑取1環(huán)新鮮的菌落接入裝有5mL液體種子培養(yǎng)基的試管中，28℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h，測OD600，按終濃度為1×107個細胞/mL的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基。隨后在28℃，轉(zhuǎn)速200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。

兩相培養(yǎng)體系:在培養(yǎng)12 h時，再往上述單相培養(yǎng)體系中加入一定體積的萃取劑(萃取劑以無菌方式加入)。

1.4 分析方法

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心15 min后分別收集上清液和菌體，取少量上清液用高效液相色譜法測定L-Phe和2-苯乙醇含量［3］。菌體沉淀用蒸餾水洗滌3次后烘干，稱細胞干重，測定生物量。

兩相培養(yǎng)體系中的2-苯乙醇含量測定，先將發(fā)酵液以12 000 r/min離心5 min得到水相和萃取相，水相直接用高效液相色譜法測2-苯乙醇含量，萃取相則用5倍甲醇稀釋后再測2-苯乙醇含量，總含量由如下公式計算得到:

其中，PPEA:2-苯乙醇產(chǎn)量;C水相:水相中的2-苯乙醇含量;C有機相:有機相中2-苯乙醇產(chǎn)量;V水相:水相的體積;V有機相:有機相的體積。

殘?zhí)菧y定:3，5-二硝基水楊酸比色法［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取劑的選擇及萃取比例的確定

2.1.1 萃取劑的種類

選擇合適的有機溶劑是在液-液兩相體系中成功進行生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵之一。對生物催化劑的生物相容性以及對底物和產(chǎn)物合適的分配系數(shù)是選擇有機溶劑的2個主要標準［5］。其中有機溶劑的生物相容性可以用其在標準水/正辛醇體系中的分配系數(shù)的對數(shù)值logP值衡量。理論研究顯示，logP＜4的有機溶劑對釀酒酵母細胞有毒性，logP在4～6之間的有機溶劑不確定，而logP＞6的有機溶劑則無毒性［6］。結(jié)合已報道的研究結(jié)果，油酸和聚丙二醇(polypropylene glycol，PPG)是較為適用的萃取劑。

課題組進一步比較了油酸和聚丙二醇對于酵母CWY132生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)2－苯乙醇的影響及萃取比例的確定。使用的聚丙二醇分子量為1 500(PPG1500)。在分別用油酸和PPG1500萃取標準品2-苯乙醇水溶液的時候，兩者都能在較短時間內(nèi)有效地將2-苯乙醇抽提到有機相中;而應用在活細胞轉(zhuǎn)化過程中，兩者則差異較大。表1是生物轉(zhuǎn)化過程中酵母產(chǎn)2-苯乙醇含量的高效液相色譜測定結(jié)果。試驗中，培養(yǎng)體系為500mL搖瓶中分別裝發(fā)酵液100mL(單相)、發(fā)酵液/油酸各 50mL，以及發(fā)酵液/PPG1500各50mL。

表1 兩相體系中有機溶劑對酵母CWY132生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)2-苯乙醇的影響

結(jié)果顯示，水/PPG1500兩相體系的產(chǎn)量最高，且由于分配系數(shù)較大，通過產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移(ISPR)使殘留在水相中的2-苯乙醇降低到了0.12g/L，可有效解除水相中的產(chǎn)物抑制作用。另一方面，油酸與水易形成乳化狀態(tài)，而且從高效液相色譜結(jié)果可見油酸萃取到的2-苯乙醇中雜質(zhì)明顯偏多(結(jié)果待發(fā)表)，也為后續(xù)的分離純化帶來不便。因此，我們認為PPG1500是更為有利的萃取劑。此處兩相體系的產(chǎn)量并不比單水相高出很多，分析其原因主要是在培養(yǎng)體系中由于底物L-Phe量不多(5.8g/L)，產(chǎn)生的2-苯乙醇雖已達到較高的轉(zhuǎn)化率但終濃度仍不高，產(chǎn)物抑制作用不明顯。因此以下試驗中將提高底物LPhe的量。

2.1.2 PPG1500加入量的比較

在水/有機溶劑兩相體系中，相體積比不但影響界面面積，并且對通氣量也有一定程度的影響，從而影響生物轉(zhuǎn)化速率。試驗中，培養(yǎng)體系為250mL搖瓶中裝發(fā)酵液50mL，初始底物L-Phe濃度10g/L，糖蜜60g/L，于12 h時向50mL發(fā)酵液中分別添加10、20、30、40、50mL 的 PPG1500，200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h測定2-苯乙醇含量。結(jié)果如圖1所示。向50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20mL PPG1500所得的2-苯乙醇產(chǎn)量最高(4.82g/L)。隨著加入的PPG1500量進一步增大，2-苯乙醇產(chǎn)量逐級遞減，其原因可能是PPG1500密度小，在振蕩培養(yǎng)的過程中覆蓋在水相上，影響了通氣量從而抑制菌體的生長，導致了2-苯乙醇的產(chǎn)量減少。而當PPG1500的量降低到10mL時，由于分配系數(shù)的限制，殘留在水相中的2-苯乙醇明顯增多，從而影響了菌體的生長代謝。

圖1 液-液兩相體系中PPG1500加入量的優(yōu)化

2.2 液-液兩相單批培養(yǎng)

以PPG1500為抽提相的液-液兩相ISPR單批培養(yǎng)過程如圖2所示，培養(yǎng)體系為250mL搖瓶中裝發(fā)酵液50mL，初始底物L-Phe濃度10g/L，糖蜜60g/L，于12 h時加入20mL PPG1500，定時取樣分析后繪制曲線。

菌種轉(zhuǎn)接后延滯期非常短，培養(yǎng)前期生物量迅速增長，12 h后生長才逐漸平穩(wěn)，48 h時生物量(細胞干重)接近10g/L。與此相應的，在接種12 h時殘?zhí)且呀抵脸跏剂康?%左右，L-Phe也降至初始量的30%左右，隨后才逐漸平穩(wěn)。產(chǎn)物2-苯乙醇則隨著培養(yǎng)時間逐漸積累，在菌體的對數(shù)生長后期(48 h)時產(chǎn)量達到最高。Wittmann等曾報道Kluyveromyces marxianus產(chǎn)2-苯乙醇主要是在對數(shù)生長期［7］。因此，采用補料分批培養(yǎng)體系，延長酵母菌株CWY 132的對數(shù)生長后期時間以及添加底物L-Phe，是進一步提高2-苯乙醇產(chǎn)量的可行途徑。

圖2 液-液兩相單批培養(yǎng)過程

2.3 分批補料培養(yǎng)

2.3.1 針對碳源的分批補料培養(yǎng)

在分批補料培養(yǎng)中，分別在 0、4、8、12、24 h 補加一定量的糖蜜，L-Phe初始量增加到15g/L，12 h時加入20mL的PPG1500，結(jié)果如表2所示。

表2 糖蜜的分批補料

表2結(jié)果表明，糖蜜分批補加對2-苯乙醇產(chǎn)量的促進作用十分顯著，隨著總糖量的增加，體系的2-苯乙醇產(chǎn)量隨之增長，總糖蜜為200g/L時產(chǎn)量最高達到了6.86g/L。而當總糖蜜進一步增加時產(chǎn)量反而開始下降，由此可見，高糖濃度對2-苯乙醇產(chǎn)量也有抑制作用。因此，將碳源分批補加，使體系中的糖濃度控制在一定的水平，有利于2-苯乙醇生產(chǎn)。

2.3.2 底物L-Phe的添加時間及方式對2-苯乙醇產(chǎn)量的影響

在上述總糖蜜為200g/L的分批補料培養(yǎng)(Ⅳ)中，將L-Phe分批次于不同時間添加，結(jié)果如表3所示。L-Phe的添加時間及方式對2-苯乙醇產(chǎn)量有顯著的影響。在發(fā)酵初期(0 h)一次性加入15g/L L-Phe，2-苯乙醇產(chǎn)量最低;而接種4、8 h后分別加入12、3g/L的L-Phe的分批補料培養(yǎng)中，2-苯乙醇產(chǎn)量最高為9.03g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達到0.82 mol/mol，其中抽提相中2-苯乙醇濃度高達22.5g/L。

表3 L-Phe的分批補料培養(yǎng)

3 討論與結(jié)論

產(chǎn)物抑制是酵母生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-苯乙醇中的主要限制因素，而產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移技術(shù)是最有效的解決方法之一。Stark等在研究Saccharomyces cerevisiae Giv 2009產(chǎn)2-苯乙醇中，利用油酸/水兩相生物轉(zhuǎn)化體系，166 h后使2-苯乙醇最終總濃度達到了12.6g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為 0.91 mol/mol［8］。梅建鳳等［9］利用油酸/水兩相體系(3∶1)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)18 h后，14g/L L-Phe生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的總濃度為5.03g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.49 mol/mol。除了液-液兩相培養(yǎng)方式外，Stark［10］等報道了采用癸二酸二丁酯微膠囊，關(guān)昂［11］等報道了使用大孔樹脂固體吸附的原位產(chǎn)物分離技術(shù)生產(chǎn)2-苯乙醇，也都取得了良好的效果。但是在上述研究中，碳源都是葡萄糖而不是糖蜜。

糖蜜的主成分為蔗糖是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，以糖蜜為碳源生產(chǎn)2-苯乙醇可以大幅度降低生產(chǎn)成本，但是相關(guān)的研究報道還較少。Etschmann等以糖蜜為碳源對Kluyveromyces marxianus CBS 600在油醇(oleyl alcohol)/水兩相體系的生物轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化，使2-苯乙醇產(chǎn)量提高了87%，達到5.6g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為 0.83 mol/mol［2］。隨后，Etschmann 等人又利用PPG1200/水兩相體系，得到2-苯乙醇產(chǎn)量為10.2g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為 0.82 mol/mol［12］。

本文選用國產(chǎn)的PPG1500作為ISPR技術(shù)中的抽提劑，對釀酒酵母CWY132以糖蜜為碳源生產(chǎn)2-苯乙醇的液-液兩相培養(yǎng)進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)液-液兩相培養(yǎng)并結(jié)合分批補料工藝可以大幅度提高2-苯乙醇的產(chǎn)量，在PPG1500的添加量與培養(yǎng)基的體積比為2∶5的液-液兩相單批培養(yǎng)中，2-苯乙醇的產(chǎn)量為4.82g/L(表2);但在0、4、8、12、24 h 分別添加40g/L糖蜜，并且在4、8 h分別添加12、3g/L L-Phe的液-液兩相分批補料培養(yǎng)中，2-苯乙醇的產(chǎn)量提高了87%，達到9.03g/L，底物的摩爾轉(zhuǎn)化率為0.82 mol/mol(表3)。這一產(chǎn)量已達到Etschmann等報道的產(chǎn)量水平［12］。據(jù)推測，延長對數(shù)生長后期時間以及提高底物L-Phe的利用率可能是提高釀酒酵母CWY132以糖蜜為碳源生產(chǎn)2-苯乙醇效率的重要原因。

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Studies on the Fermentation Conditions for Production of 2-phenylethanol by Saccharomyces cerevisiae CWY132 in a Molasses-based Medium

Cui Zhi-feng，Shen Qing-jia，Wang Kun，Zhu Ting-heng
(College of Biology and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

Two-phase fed-batch fermentation conditions for the production of 2-phenylethanol by Saccharomyces cerevisiae CWY132 in a molasses-based medium were studied.The 2-phenylethanol was obviously increased by fedbatch for molasses and L-phenylalanine in the Aqueous-polypropylene glycol two-phase culture.Under the optimized two-phase fed-batch conditions，the yield of 2-phenylethanol reached up to 9.03g/L，increased by 87%compared with the original 4.82g/L.The molar conversion rate of L-phenylalanine to 2-phenylethanol rises to 0.82 mol/mol.

Saccharomyces cerevisiae，2-phenylethanol，molasses，fed-batch culture

博士，副教授。

*浙江省教育廳項目(20070188)

2010－03－08，改回日期:2010－09－15