孟憲軍,王 瓊,＊,魏 杰

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110161;2.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院,遼寧沈陽 110036)

大孔樹脂純化金褐霉素的研究

孟憲軍1,王 瓊1,＊,魏 杰2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110161;2.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院,遼寧沈陽 110036)

通過比較八種大孔樹脂對(duì)金褐霉素發(fā)酵液的吸附和解吸效果,從中篩選出適合金褐霉素分離純化的樹脂,并對(duì)其吸附和解吸性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明,X-5樹脂最適合金褐霉素的純化,洗脫劑甲醇的體積分?jǐn)?shù)為 80%,上樣液pH5.0,洗脫液 pH7.0,吸附流速為 1.0BV/h,洗脫流速為1mL/min,此方法所得金褐霉素純度較高,且有明顯的脫色效果。

大孔吸附樹脂,金褐霉素,純化,HPLC法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金褐霉素提取液 本實(shí)驗(yàn)室自制;甲醇 分析純,沈陽化學(xué)試劑廠;X-5大孔吸附樹脂 天津南開大學(xué)化工廠;HPD100、HPD400、HPD600、HPD200A、AB-8大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司;D101大孔吸附樹脂 上海邁坤化工有限公司;WD-6大孔陰樹脂 安徽皖東化工有限公司。

SBA-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器、HL-2S恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;玻璃層析柱 Ф1cm× 30cm 華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司;SH2-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;高效液相色譜儀 美國Waters;FA1104電子天平 上海天平儀器廠; pHS-25型酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠;DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液預(yù)處理 取發(fā)酵液加入離心管,充分振蕩后高速離心 (10000r/min,10min)所得上清液即為待測(cè)液。

1.2.2 樹脂預(yù)處理 樹脂采用常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理,預(yù)處理流程如下：以 0.5BV(1BV為 1個(gè)樹脂床體積)的乙醇浸泡樹脂 24h;用 2BV乙醇以 2BV/h的流速通過樹脂柱,并浸泡樹脂 4～5h;用乙醇 2BV/h的流速洗滌樹脂,至流出液加水不呈白色混濁為止,再用水以同樣流速洗凈乙醇;用 2BV的 5%HCl溶液以4～6BV/h的流速通過樹脂層,并浸泡樹脂 2～4h,而后用水以同樣流速洗至出水 pH呈中性;用 2BV的2%NaOH溶液以 4～6BV/h的流速通過樹脂層,并浸泡樹脂 2～4h,而后用水以同樣流速洗至出水 pH呈中性[8]。

1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附率及解析率測(cè)定 準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理的大孔樹脂 1.00g,置于 100mL具塞三角瓶中,加入 20mL金褐霉素提取液,置于室溫振蕩吸附 24h后,測(cè)定金褐霉素提取液的濃度。用蒸餾水洗去溶液中殘余金褐霉素后吸干水分,然后用甲醇洗脫樹脂,分別測(cè)定洗脫液中金褐霉素的濃度,計(jì)算各樹脂的吸附率及解析率。

吸附率Q(%)=(C0-C1)×100%/C0

式中：Q-吸附率(%);C0-吸附前濃度,mg/mL; C1-吸附后濃度,mg/mL。

解吸率D(%)=C2×100%/(C0-C1)

式中：D-解吸率(%);C0-吸附前濃度,mg/mL; C1-吸附后濃度,mg/mL;C2-解吸后濃度,mg/mL。

1.2.4 上樣液最適 pH的選擇 將金褐霉素提取液用NaOH或 HCl溶液調(diào)至不同的 pH,上柱,依次用200mL同樣 pH的蒸餾水及甲醇進(jìn)行洗脫,收集甲醇洗脫液,測(cè)定金褐霉素的濃度,確定其最佳 pH。

1.2.5 洗脫液最適 pH的選擇 取一定量的金褐霉素提取液上柱,先用蒸餾水洗脫至無色后,依次用200mL不同 pH的甲醇進(jìn)行洗脫,收集不同 pH的甲醇洗脫液,測(cè)定其金褐霉素的濃度,以確定最佳的洗脫劑pH。

1.2.6 洗脫劑濃度的選擇 取一定量的金褐霉素提取液上柱,先用蒸餾水洗脫至無色后,依次用 200mL 20%～100%濃度的甲醇溶液進(jìn)行洗脫,收集不同濃度的甲醇洗脫液,測(cè)定金褐霉素的濃度,以確定最佳的洗脫劑濃度。

1.2.7 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析實(shí)驗(yàn) 樹脂濕法裝柱(1.0cm×30.0cm),分別以 0.5、1.0、1.5BV/h的流速加入一定體積濃度的金褐霉素的供試液,待樣品溶液全部通過樹脂柱后,分步收集流出液 (每管25mL),定時(shí)檢測(cè)流出液中金褐霉素的濃度,當(dāng)達(dá)到泄漏濃度時(shí),視為吸附完全,確定最佳吸附流速。

取一定體積濃度的金褐霉素供試液上柱,待吸附飽和后,用 2BV的蒸餾水洗滌后,再用甲醇分別以0.5、1.0、1.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫,分段收集洗脫液(每管 25mL),測(cè)其金褐霉素含量,確定其最佳洗脫流速。

1.2.8 金褐霉素測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂對(duì)金褐霉素的靜態(tài)吸附與解析效果比較

物質(zhì)在溶劑中的溶解度大,樹脂對(duì)此物質(zhì)的吸附力就小,反之就大。吸附實(shí)驗(yàn)前將金褐霉素提取液進(jìn)行減壓濃縮,在溫度 25℃,轉(zhuǎn)速 100r/min的條件下進(jìn)行吸附和解吸,再用 100%甲醇進(jìn)行洗脫,吸附和解吸時(shí)間均為 24h,8種大孔吸附樹脂篩選結(jié)果顯示如表1。

表 1 大孔樹脂對(duì)金褐霉素的靜態(tài)吸附與解析性能

從表 1中可以看出,HPD400,X-5,WD-6,AB-8四種樹脂的吸附率較高,均可達(dá)到 70%以上,X-5達(dá)78.7%。在生產(chǎn)上不僅要求樹脂吸附率大,還要求解吸率高,以保證有效成分最大限度回收。因此,解吸率也是樹脂實(shí)驗(yàn)考察的重要指標(biāo)。由表 1可知, HPD100樹脂和X-5樹脂的解吸率較好,綜合吸附率和解吸率兩個(gè)指標(biāo),因而選定 X-5型樹脂作為較適宜的填料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 上樣液 pH對(duì) X-5樹脂吸附性能的影響

在溶液介質(zhì)中,金褐霉素的結(jié)構(gòu)會(huì)隨 pH的降低或升高而發(fā)生降解。金褐霉素在 pH4～8的范圍內(nèi)較穩(wěn)定,因此,將 pH的考察范圍設(shè)定為 4、5、6、7、8進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖 1可知,上樣液 pH為 5時(shí),樹脂對(duì)金褐霉素的吸附率最高,上樣液 pH為 8時(shí)次之。而發(fā)酵達(dá)到終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液 pH在 5～6.5范圍內(nèi),因此,可稍微調(diào)整或不用調(diào)整發(fā)酵液的 pH直接進(jìn)行吸附。

圖 1 上樣液pH對(duì)樹脂吸附金褐霉素的影響

2.3 洗脫液 pH對(duì)解吸的影響

洗脫液的 pH對(duì)金褐霉素的洗脫能力有影響。通過改變洗脫液的 pH,可使吸附物形成較強(qiáng)的離子化合物,很容易被洗脫下來,從而提高洗脫率。

圖 2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著 pH逐漸升高,解吸率逐漸升高,在 pH為 7時(shí),X-5樹脂對(duì)金褐霉素的解吸效果最好,且有明顯的脫色效果。但當(dāng) pH為 8時(shí),解吸率陡然下降,說明洗脫液的 pH對(duì)解吸率的影響很大。

圖 2 洗脫液pH對(duì)樹脂解吸金褐霉素的影響

2.4 洗脫劑濃度的確定

將已吸附金褐霉素飽和的 X-5樹脂等分成 9份,分別用不同濃度的甲醇溶液作為解析劑,測(cè)定解析液的金褐霉素含量,計(jì)算解析率。圖 3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著甲醇濃度的逐漸升高,解吸率逐漸升高,在甲醇濃度達(dá)到 100%時(shí),解吸率達(dá)到最高。甲醇濃度在 80%～100%之間,解吸率相差不是很大?？紤]到節(jié)約成本,可以選用 80%甲醇作為洗脫劑。

圖 3 洗脫劑濃度對(duì)樹脂解吸金褐霉素的影響

2.5 上樣液流速對(duì)樹脂吸附的影響

流出液中的目的產(chǎn)物濃度達(dá)到進(jìn)口濃度的 10%時(shí),即為吸附終點(diǎn)。達(dá)到吸附終點(diǎn)時(shí)上樣液的體積值就是泄露點(diǎn)。從圖 4可以看出,流速越大,層析柱的泄漏點(diǎn)越提前,X-5樹脂的吸附效果隨著流速的增加而降低。這是因?yàn)榇罂孜綐渲闹鶎游鍪嵌喾肿訉游?是一種動(dòng)態(tài)吸附過程。流速對(duì)吸附的影響主要是影響溶質(zhì)向樹脂內(nèi)表面擴(kuò)散,從而影響了吸附效率。流速過快,接觸時(shí)間短,金褐霉素還沒來得及與樹脂內(nèi)表面接觸就流出吸附柱,極大降低吸附效果。雖然低流速對(duì)吸附有利,但流速過低,操作時(shí)間長(zhǎng),效率較低。當(dāng)流速為 0.5BV/h和 1.0BV/h時(shí)的泄露點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間接近,所以從提高效率考慮,選擇 1.0BV/h為最佳上柱流速。

圖 4 吸附流速對(duì)金褐霉素吸附效果的影響

2.6 洗脫流速的確定

一般情況下,洗脫流速過大,洗脫溶劑還沒來得及交換和溶解大孔吸附樹脂上被吸附的有效成分,就從柱中流出,從而沒有達(dá)到分離純化的目的,而且也極其耗費(fèi)溶劑;但洗脫流速過小,洗脫時(shí)間就會(huì)增加。在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)綜合考慮,選用合適洗脫流速,既要使大孔吸附樹脂的洗脫效果好,又要保證較高的工作效率[10]。實(shí)驗(yàn)用甲醇溶劑以不同的洗脫流速對(duì)飽和吸附的樹脂進(jìn)行洗脫,分析結(jié)果見圖 5。

圖 5 洗脫流速對(duì)金褐霉素洗脫效果的影響

從圖 5中可以看出,流速對(duì)洗脫效果有明顯影響,流速越高,洗脫時(shí)脫尾現(xiàn)象越明顯,所需洗脫劑也就越多。以 0.5mL/min和 1.0mL/min流速洗脫金褐霉素,峰形陡峭,峰值較高,綜合考慮實(shí)驗(yàn)效率,控制洗脫流速在 1.0mL/min為佳,此時(shí)既能達(dá)到滿意效果,又能提高洗脫效率。

3 結(jié)論

金褐霉素可以通過用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化。通過對(duì)八種樹脂吸附性能對(duì)比篩選,認(rèn)為 X-5樹脂最適合金褐霉素的純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為 80%,上樣液 pH5.0,洗脫液 pH7.0,吸附流速為 1.0BV/h,洗脫流速為 1mL/min時(shí),此方法所得金褐霉素純度較高,且有明顯的脫色效果。

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Study on the purification of aureofuscin by macroporous resin

M ENG Xian-jun1,WANG Qiong1,＊,W EI Jie2
(1.Food SciencesAcademy,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang 110161,China; 2.Life and SciencesAcademy,LiaoningUniversity,Shenyang 110036,China)

Through the comp a rison am ong the e ight typ es of m ac rop orous res in adsorp tion and desorp tion ra te of aureofusc in,the op tiona l m ac rop orous res in for aureofusc in was dec ided,and absorp tion and desorp tion cap ab ilities of aureofusc in we re s tud ied.The results showed tha t X-5res in was the bes t one for the p urifica tion of aureofusc in,w ith80%m e thanol as e luant.Samp le pH was5.0,and flowed pH was7.0.The m oving sp eed was 1.0BV/h and the e luting sp eed was1.0mL/m in.Then,highe r p roduc t p urity and c lea r effec t on decolored can be ob ta ined.

m ac rop orous res in;aureofusc in;p urifica tion;HPLC m e thod

TS201.1

B

1002-0306(2010)02-0277-03

金褐霉素 (Aureofuscin)是鏈霉菌新種—金褐鏈霉菌 (Streptomyces aureofuscus.n.sp)產(chǎn)生的一種四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與國外文獻(xiàn)報(bào)道的納他霉素(Natamycin)結(jié)構(gòu)相似。早期研究表明,金褐霉素對(duì)霉菌、多種酵母菌及絲狀真菌有很強(qiáng)的抗菌作用,但不抗細(xì)菌,臨床上用于治療真菌性角膜炎,其療效優(yōu)于兩性霉素 B,同時(shí)對(duì)一些真菌引起的皮膚病及霉菌性陰道炎等也有很好療效。金褐霉素早在 1975年發(fā)現(xiàn)時(shí)只作了早期化學(xué)結(jié)構(gòu)和初步藥效實(shí)驗(yàn)后,一直未作深入研究和進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)[1-3]。迄今為止,國內(nèi)真正擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的四烯類抗生素只有金褐霉素。在 1997年我國正式批準(zhǔn)使用納他霉素作為安全食品防腐劑后,金褐霉素才被重新重視起來,由于未作高產(chǎn)菌種選育和分離提取工藝的深入研究,發(fā)酵單位和提取收率都不高,難以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化開發(fā)要求[4-6]。鑒于金褐霉素與納他霉素有著相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性,而納他霉素現(xiàn)在主要依賴進(jìn)口,因此,金褐霉素的研究開發(fā)在真菌疾病的防治和食品防腐上顯示出了極好的應(yīng)用前景和市場(chǎng)潛力,這對(duì)促進(jìn)新藥研制、食品防腐和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展都具有積極意義。目前關(guān)于金褐霉素分離提取方面的研究鮮有報(bào)道。大孔吸附樹脂是近十年來發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑,廣泛用于生物活性物質(zhì)的分離提取[7]。本研究采用 8種不同類型大孔吸附樹脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行吸附和解吸,從中篩選出適合金褐霉素分離純化的樹脂,并對(duì)其吸附和解吸性能進(jìn)行研究,優(yōu)化大孔樹脂分離純化金褐霉素的工藝,為金褐霉素的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

2009-04-17 ＊通訊聯(lián)系人

孟憲軍(1960-),男,教授,沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院院長(zhǎng),研究方向：食品制造與保藏。