張綿松,袁文鵬,王小軍,孟秀梅,夏雪奎,劉昌衡,＊

(1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心,山東濟南 250014; 2.山東省科學(xué)院生物研究所,山東濟南 250014; 3.山東省科學(xué)院海洋食品生物技術(shù)研發(fā)平臺,山東濟南 250014)

海蜇皮水解條件的研究

張綿松1,3,袁文鵬2,3,王小軍2,3,孟秀梅2,3,夏雪奎1,3,劉昌衡2,3,＊

(1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心,山東濟南 250014; 2.山東省科學(xué)院生物研究所,山東濟南 250014; 3.山東省科學(xué)院海洋食品生物技術(shù)研發(fā)平臺,山東濟南 250014)

以肽含量為指標(biāo),對海蜇皮的水解用酶進行了選擇,認(rèn)為風(fēng)味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解效果較好,并對這兩種酶進行了單因素實驗,結(jié)果表明：底物濃度為 2%時,風(fēng)味蛋白酶較好的水解條件為 45℃、pH6.0、加酶量 2700U/g,水解 90min,肽提取率可達 62.5%;真菌酸性蛋白酶較好的水解條件為 55℃、pH2.5、加酶量 2000U/g,水解 90min,肽提取率可達74.7%。

海蜇,膠原蛋白,肽含量,水解條件

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海蜇皮 山東榮成好當(dāng)家集團提供;Alcalase 2.4L(酶活為 2.98×105U/mL)、復(fù)合蛋白酶 Protamex (酶活為 1.31×104U/g)、風(fēng)味蛋白酶 Flavourzyme 500MG(酶活為 6.83×104U/g) 由諾維信公司提供;真菌酸性蛋白酶 (酶活為 2.55×104U/mL) 由山東隆大生物工程有限公司提供。

FK-A型組織搗碎機、JJ-1型增力電動攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;NPCa-02氮磷鈣測定儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;HH-S21 -4S型電熱恒溫水浴鍋 上海賀德實驗設(shè)備有限公司;UV754N紫外可見分光光度計、pHS-25型 pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝 礬制海蜇皮→清水脫鹽[6]→組織搗碎機搗碎→測定水分和蛋白質(zhì)含量→冷藏備用

海蜇皮漿→加水,調(diào)節(jié)溫度和 pH→加酶水解→100℃, 10min滅酶→調(diào)整 pH至 7.0→4000r/min,離心 10min→含肽和氨基酸的上清液

1.2.2 酶的選擇 取適量的搗碎海蜇皮放入燒杯中,加入適量的緩沖液調(diào)節(jié)至所需底物濃度(蛋白濃度 2%),然后在所需的溫度下水浴 15min使之溫度均勻,加入 3000U/g的酶量啟動反應(yīng)。每隔 30min取 2mL水解液測定肽含量,以時間為橫坐標(biāo),肽含量為縱坐標(biāo)做一條水解趨勢線。幾種酶的具體的水解條件見表1。

表1 幾種蛋白酶的水解條件

1.2.3 溫度、pH、加酶量和酶的種類對肽含量的影響先固定 3000U/g的加酶量和酶的適宜 pH(真菌酸性蛋白酶為 pH3.0,風(fēng)味酶為 pH7.0),溫度均取 40、45、50、55℃四個實驗點進行實驗,確定各自較好的溫度;然后固定較好的溫度和 3000U/g的加酶量,真菌酸性蛋白酶選取 pH2.0、pH2.5、pH3.0、pH3.5、pH4.0五個實驗點,風(fēng)味酶選取 pH5.0、pH6.0、pH7.0和 pH8.0四個實驗點進行實驗,確定各自較好的pH;最后固定較好的溫度和 pH,真菌酸性蛋白酶選取1000、1500、2000、2500、3000U/g五個實驗點,風(fēng)味酶選取 600、1300、2000、2700、3400U/g五個實驗點進行實驗,以確定各自較好的加酶量。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 蛋白酶活的測定 參照 SB/T 10317-1999。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)測定 參照微量凱氏定氮法[7]。

1.2.4.3 肽含量的測定 取 2mL水解液,加入 2mL 5%TCA(三氯醋酸),用雙縮脲法測定肽的含量[7-8]。

1.2.4.4 肽提取率計算 計算公式如下：

肽提取率 (%)=水解上清液中的肽含量(mg/mL)×上清液總質(zhì)量 (g)/1000×用于水解的蛋白總質(zhì)量(g)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇

由圖 1可知,0～90min水解過程中,水解液中的肽含量隨著時間的延長而增加,風(fēng)味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶的增加幅度大于另外兩種蛋白酶。30min以內(nèi)的水解速度明顯大于 30～60min的水解速度,這是由于隨著水解反應(yīng)的進行,底物濃度降低,蛋白酶失活等因素的變化會使得酶的水解速度下降。90min以后,除了Alcalase,其它三種蛋白酶的水解曲線都有不同程度的下降,此外,復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的水解曲線還有稍微的起伏,這是因為酶中的外切速度大于內(nèi)切速度,部分酶解產(chǎn)生的肽被水解成氨基酸,所以使得曲線下降;同時大分子蛋白質(zhì)也在水解產(chǎn)生肽,所以時而曲線會有起伏?？偟膩碚f,在同等水解條件下,真菌酸性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的水解效果明顯好于其它兩種蛋白酶,圖 2表明水解 3h后,這兩種酶的肽含量和蛋白提取率仍然大于其它兩種蛋白酶,所以選擇這兩種蛋白酶作為海蜇多肽的水解用酶。因為在 90min以前,是內(nèi)切起主導(dǎo)作用,肽含量呈上升趨勢,所以選擇 90min的水解時間來優(yōu)化這兩種酶的水解條件。

圖 1 四種蛋白酶水解過程中肽含量隨時間的變化曲線

圖2 四種蛋白酶的水解效果

2.2 溫度對肽含量的影響

風(fēng)味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解過程中肽含量隨溫度的變化分別見圖 3和圖 4。根據(jù)海蜇膠原蛋白的特性,海蜇在超過 50℃的水中,蛋白質(zhì)開始硬化變性,部分卷曲;60℃時則卷曲變小,隨著蛋白質(zhì)的分子不對稱程度變化,構(gòu)象也變化,使得蛋白質(zhì)的分子趨于纖維狀[9],所以 50℃以后水解效果明顯下降。風(fēng)味蛋白酶水解肽含量在 45℃時明顯高于其它溫度,所以,選擇 45℃作為風(fēng)味酶的水解溫度。然而膠原蛋白在強酸和強堿下具有的膨潤特性[10]卻使得其在 pH3.0的條件下的真菌酸性蛋白酶水解效果大不一樣,圖 4表明在 55℃時真菌酸性蛋白酶的水解肽含量最高,考慮到真菌酸性蛋白酶本身的熱穩(wěn)定性,所以選用 55℃作為真菌酸性蛋白酶的水解溫度。

圖 3 風(fēng)味蛋白酶水解肽含量隨溫度的變化

2.3 pH對肽含量的影響

風(fēng)味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解過程中肽含量隨 pH的變化分別見圖 5和圖 6。圖 5表明,pH6.0時風(fēng)味蛋白酶水解肽含量大于其它 pH條件,pH6.0為較好的水解條件。從圖 6可知,真菌酸性蛋白酶的較好 pH條件為 pH2.5,這正好也是膠原蛋白產(chǎn)生最大膨潤的 pH條件[10]。膨潤后底物能更好地與酶結(jié)合,提高水解效率。

圖 4 真菌酸性蛋白酶水解肽含量隨溫度的變化

圖 5 風(fēng)味蛋白酶水解肽含量隨pH的變化

圖 6 真菌酸性蛋白酶水解肽含量隨 pH的變化

2.4 加酶量對肽含量的影響

風(fēng)味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解過程中肽含量隨加酶量的變化分別見圖 7和圖 8。圖 7曲線較為平緩,這說明加酶量對風(fēng)味蛋白酶的影響并不是太大,較好的加酶量為2700U/g;真菌酸性蛋白酶在加酶量高于 2000U/g時肽含量有下降的趨勢,可能提前進入肽的水解階段。在考察的實驗條件下,認(rèn)為 2000U/g為真菌酸性蛋白酶的較好水解加酶量。

圖 7 風(fēng)味蛋白酶水解肽含量隨加酶量的變化

圖 8 真菌酸性蛋白酶水解肽含量隨加酶量的變化

3 結(jié)論

在相同的加酶量和各自的較適水解條件下,風(fēng)味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶的水解肽含量要明顯高于Alcalase和復(fù)合蛋白酶,通過單因素實驗,認(rèn)為以肽含量為指標(biāo),底物濃度為 2%時,風(fēng)味蛋白酶較好的水解條件為：45℃,pH6.0,加酶量 2700U/g;真菌酸性蛋白酶較好的水解條件為：55℃,pH2.5,加酶量2000U/g。在較好條件下水解 90min,風(fēng)味蛋白酶的肽提取率可達 62.5%,真菌酸性蛋白酶的肽提取率可達 74.7%。本實驗結(jié)論可以為海蜇多肽的活性研究和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

[1]Y-H P Hsieh,F M Leong,J Rudloe.Jellyfish as food[J]. Hydrobiologia,2001,451：11-17.

[2]曹文紅,章超樺,秦小明 .酶解中國毛蝦制備低分子肽的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(11)：80-83.

[3]曾名勇,崔海英,李八方 .海洋生物活性肽及其生物活性研究進展[J].中國海洋藥物雜志,2005,24(1)：46-51.

[4]林偉鋒,趙謀明,姚毓才 .應(yīng)用酶解技術(shù)開發(fā)利用海洋食品資源[J].食品工業(yè)科技,2002(11)：90-93.

[5]金桂芬,裘俊紅 .海蜇膠原蛋白優(yōu)化提取條件的研究[J].浙江化工,2008,39(7)：5-9.

[6]崔靜 .預(yù)混料型方便海蜇食品的研制[D]：江南大學(xué)食品學(xué)院,2008.

[7]無錫輕工業(yè)學(xué)院,天津輕工業(yè)學(xué)院 .食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1983：224-226.

[8]沈同,王鏡巖.生物化學(xué)[M].第二版.北京：高等教育出版社,1998：112-115.

[9]王彩云 .對海蜇深加工的研究 [J].食品工業(yè),1993(1)：13-14.

[10]江晃榮 .膠原蛋白的驚人療效 [M].臺灣世茂出版集團,2002.

Study on the hydrolysis conditions of jellyfish

ZHANGM ian-song1,3,YUANW en-peng2,3,WANG Xiao-jun2,3, M ENG Xiu-mei2,3,XIA Xue-kui1,3,L IU Chang-heng2,3,＊
(1.Biotechnology Center of ShandongAcademy of Sciences,Jinan 250014,China; 2.Biology Institute of ShandongAcademy of Sciences,Jinan 250014,China; 3.Platform ofMarine Food Biotechnology,ShandongAcademy of Sciences,Jinan 250014,China)

Accord ing to the p ep tide content,the collec tion of enzym es for je llyfish was ca rried out,hyd rolyza tion of Flavourzym e and funga l ac id p rotease we re be tte r than the othe r enzym es.The results of s ing le fac tor exp e r im ent showed tha twhen the subs tra te concentra tion was2%,the be tte r hyd rolys is cond itions of Flavourzym e and funga l ac id p roteasewe re 45℃,pH6.0,enzym e dosage 2700U/g and 55℃,pH2.5,enzym e dosage 2000U/g, hyd rolyza tion t im e90m in,resp ec tive ly.Unde r these cond itions,the p ep tide extrac tion ra te was62.5%and74.7%, resp ec tive ly.

je llyfish;collagen;p ep tide content;hyd rolys is cond itions

TS254.1

B

1002-0306(2010)02-0258-03

海蜇,又名水母,屬腔腸動物。新鮮海蜇含水量約為 96%,蛋白質(zhì)含量約 2.92%,脂肪含量小于0.01%。除水外,蛋白質(zhì)成為海蜇的主要成分,且以膠原蛋白為主[1]。已有研究表明,從海蜇中提取的膠原蛋白可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]。研究發(fā)現(xiàn),低分子肽較氨基酸更易為人體所吸收,且具有某些特殊的生理功能,如可降低血液中的膽固醇、清除自由基、預(yù)防和治療高血壓、促進鈣質(zhì)吸收、增強機體免疫力、促進肉芽生長從而加速傷口愈合等[2]。來自海洋生物的活性肽盡管研發(fā)歷史較短,但因其具有的獨特生理功能而異軍突起,成為活性肽領(lǐng)域的研究熱點[3]。日本、歐美等國把海洋生物中功能肽系列產(chǎn)品的研究與開發(fā)作為發(fā)展海洋保健食品和藥物的一個重要方向,并取得了豐碩的成果[4]。我國食用海蜇資源豐富,每年在海蜇的加工過程中都將出現(xiàn)大量的資源浪費,更嚴(yán)重的是直接導(dǎo)致環(huán)境的污染。近幾年來,組合生物技術(shù)等高新技術(shù)的發(fā)展使具有生物功能的低分子活性肽的開發(fā)成為水產(chǎn)品高值化利用領(lǐng)域的研究熱點。而且海蜇膠原蛋白在低抗原性、低過敏性、分子結(jié)構(gòu)脆弱導(dǎo)致酶解較容易等方面具有一定的優(yōu)勢[5]。因此開發(fā)利用海蜇及其廢棄物提取膠原蛋白,生產(chǎn)具有各種生理功能的活性肽具有廣闊的應(yīng)用前景。

2009-03-05 ＊通訊聯(lián)系人

張綿松(1982-),男,碩士,研究方向：海洋食品生物技術(shù)。