楊 洋,黃 濤,關(guān)紅艷,吳小玉

(1.廣西大學生命科學與技術(shù)學院,廣西南寧 530004; 2.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

桑葉多酚氧化酶的固定化及酶學性質(zhì)研究

楊 洋1,黃 濤2,關(guān)紅艷2,吳小玉1

(1.廣西大學生命科學與技術(shù)學院,廣西南寧 530004; 2.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

研究了桑葉多酚氧化酶(PPO)的動力學特性,結(jié)果表明,其最適溫度為 40℃,最適 pH為 7.0,酶動力學參數(shù)Km=0.093mol/L。用濃度質(zhì)量分數(shù)為 4%海藻酸鈉、體積分數(shù)為 0.2%戊二醛、0.2mol/L的 CaCl2固定多酚氧化酶,固定時間 2h,交聯(lián)時間 4h,能使固定化多酚氧化酶的活力達到最大。固定化酶的最適 pH為 6.0,固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為 50℃,固定化酶對溫度的敏感度降低,溫度變化對固定化酶酶活力的影響不大。

桑葉,多酚氧化酶,動力學,固定化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 PPO 實驗室自制;考馬斯亮藍 G-250、鄰苯二酚、焦性沒食子酸、間苯二酚、對苯二酚、二苯胺、對氨基苯磺酸、聚乙二醇 20000、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺 (Acr)、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、殼聚糖、醋酸、石蠟、硅藻土、海藻酸鈉、戊二醛、Tween 80、KH2PO4、Na2HPO4等化學試劑 均為分析純。

掃描電子顯微鏡 S-3400N 購自日本日立公司;PL2002電子天平 購自特勒-托利多儀器有限公司;UV1240型紫外分光光度計 購自日本島津公司;BECK MAN J2-MC高速冷凍離心機 購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 掃描電子顯微鏡觀測 PPO結(jié)構(gòu)

將桑葉 PPO冷凍干燥樣品固定在觀測臺上,然后噴金,以掃描電子顯微鏡 S-3400N觀測 PPO分子形態(tài),同時觀測其均一性程度。

1.3 PPO的 SDS-PAGE電泳純度鑒定、分子量測定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶的純度和測定分子量。

1.4 酶活性和蛋白質(zhì)含量測定方法

1.4.1 桑葉 PPO活性測定 參照楊昌鵬等人報道的分光光度計比色法[7],取磷酸鹽緩沖液 3.9mL,加入0.02mol/L焦性沒食子酸溶液 1mL,PPO粗酶液0.1mL混勻后在 30℃下反應(yīng) 5min,在 420nm波長下測定其吸光度的變化,每 60s記錄一次OD值隨時間的變化,以最初直線段的斜率計算酶活力。一個酶活力單位定義為：在測定條件下,每分鐘引起吸光度改變 0.001所需的酶量。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍法(Bradford法)[8],以牛血清蛋白為標準,在 595nm波長下測定酶液的蛋白質(zhì)含量;但在層析過程中以收集液的吸光光度值 (OD280)來表示蛋白質(zhì)含量的變化。

1.5 酶學性質(zhì)研究

1.5.1 底物專一性 測定底物專一性時,分別以0.02mol/L的鄰苯二酚、焦性沒食子酸、間苯二酚、對苯二酚、二苯胺、對氨基苯磺酸為底物,測定 PPO活性。

1.5.2 動力學參數(shù)米氏常數(shù) Km測定 取 5組試管,每組 4支試管,1支空白,3支平行管。每支試管分別加入 3.9mL的磷酸鹽緩沖溶液,每組分別加入 30、20、10、5、1mmol/L焦性沒食子酸為底物,0.1mL酶液,在 30℃條件下反應(yīng) 5min后,測定 420nm處的吸光度,以反應(yīng)物 420nm處吸光度直接表示活力大小。測定 PPO活性,根據(jù) Lineweawer-Burk[9]雙倒數(shù)作圖法計算其Km值。

1.6 桑葉 PPO的固定化

1.6.1 固定化方法

1.6.1.1 樹脂法 取 0.5g樹脂AB-8,加入多酚氧化酶 4mg,和磷酸緩沖液 (0.1mol/L,pH6.0)1mL,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度0.1%,30℃下交聯(lián) 8h,用蒸餾水洗去游離酶和殘余的戊二醛,于 4℃下儲存,備用。

1.6.1.2 硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法 分別往適量的硅藻土中加入多酚氧化酶 4mg,和磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)1mL,混合均勻,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度 0.1%,30℃下交聯(lián) 8h,過濾洗滌,洗去游離酶和殘余的戊二醛,加入4%海藻酸鈉,混合均勻,用注射器滴入 2%的氯化鈣溶液中,立即可以見到小球形成,且由透明變成白色并沉淀,用濾紙濾出小球體,并用相同的 CaCl2溶液浸泡 2h左右固定化,濾出小球體,操作完畢后,移入4℃的冰箱中硬化 2h,然后用蒸餾水洗滌,加入戊二醛溶液交聯(lián) 4h,再用蒸餾水洗滌,得到固定化酶。于4℃下儲存,備用。

1.6.1.3 殼聚糖微球固定法 稱取適量的殼聚糖微球載體,加入適量的多酚氧化酶液中,30℃下恒溫振蕩 1h,于4℃下放置過夜,棄去上層溶液,用大量蒸餾水反復(fù)洗滌,洗去游離酶,于 4℃下儲存,備用。

1.6.2 固定化酶的酶學性質(zhì)

1.6.2.1 固定化酶的最適反應(yīng) pH 固定化酶活力測定體系用 pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的一系列緩沖溶液,測定不同 pH下固定化酶的活力,比較不同 pH下固定化酶和游離酶的最佳反應(yīng)pH。

1.6.2.2 固定化酶的最適反應(yīng)溫度 分別在 20、30、40、50、60、70℃溫度下測定固定化酶的活力,比較不同溫度下固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀測桑葉 PPO結(jié)構(gòu)

桑葉 PPO的掃描電子顯微鏡觀測如圖 1所示,從圖中可以看到,PPO酶液經(jīng)過 Sephadex G-75凝膠柱層析分離以后,得到比較均一的結(jié)構(gòu)。同時也可以看到桑葉 PPO為纖維狀蛋白,根據(jù)觀測結(jié)果計算可知,桑葉 PPO分子長度在 4～12μm之間,寬度在0.5～1.5μm之間。具有酶活性的蛋白質(zhì)通常由幾百個氨基酸組成,其作用的底物大多數(shù)為小分子,因此酶分子與底物直接發(fā)生作用的僅僅只有一小部分氨基酸側(cè)鏈,這些與酶催化活性有關(guān)的氨基酸側(cè)鏈稱為酶的活性中心。即酶活性中心是指酶與底物結(jié)合并使之反應(yīng)的區(qū)域,一般位于酶分子表面的裂縫或凹槽,往往是疏水區(qū),可容納一個或多個小分子底物或大分子底物的一部分,這就是酶的活性中心。從圖 1可以看到,在桑葉 PPO的晶體兩端都有凹槽,應(yīng)為此酶的活性中心。

圖1 掃描電子顯微鏡觀測桑葉 PPO結(jié)構(gòu)圖

天然狀態(tài)的酶具有完整的三維空間結(jié)構(gòu),其中活性部位跟其他結(jié)構(gòu)部位相比,具有較大的柔性,也就是說酶活性部位基因的運動性較大。當?shù)蜐舛茸冃詣┳饔脮r,酶分子整體剛性部分構(gòu)象保持完整,而較柔性的活性部位的局部結(jié)構(gòu)已發(fā)生明顯變化,如活性基團的相互靠近和立體取向受到破壞,導致酶活性的喪失。

2.2 桑葉 PPO的純度鑒定及分子量測定

桑葉 PPO經(jīng)過 Sephadex G-75凝膠層析后,透析,濃縮,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,見圖 2。發(fā)現(xiàn)只有一條譜帶,說明此酶已經(jīng)達到電泳純。有關(guān)桑葉多酚氧化酶同工酶的鑒定尚待進一步研究。

圖2 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜

電泳結(jié)果如圖 2所示,可以看出桑葉 PPO的條帶堆滯在 47kDa附近,因此分子量測定約為 47kDa。

2.3 PPO酶學性質(zhì)研究

2.3.1 PPO的底物專一性 從表 1可以看出,桑葉PPO迅速地催化焦性沒食子酸的酶促氧化反應(yīng),催化鄰苯二酚的氧化反應(yīng)速率為焦性沒食子酸的 2.5倍,而對對苯二酚、沒食子酸、間苯二酚、對氨基苯磺酸的活性較小,對二苯胺則完全無催化活性。這表明焦性沒食子酸為桑葉 PPO的主要氧化底物。

表1 不同底物對酶活性的影響

2.3.2 動力學參數(shù)米氏常數(shù) 以焦性沒食子酸為底物,緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pH6.0,0.02mol/L),底物濃度分別為 30、20、10、5、1mmol/L?？偡磻?yīng)體積都為3.9mL。在 30℃下反應(yīng) 5min,以反應(yīng)物 420nm處吸光度測定酶活。以 1/[S]和 1/V為橫縱坐標作Lineweaver-Burk圖 (圖 3)。求得該 PPO催化焦性沒食子酸水解的 Km為 0.093mol/L。因此,米氏常數(shù)Km值實際上也是酶與底物親合力大小的反映,即Km值越小,酶與底物的親合力越大。

圖 3 Lineweaver-Burk圖

2.4 PPO的固定化研究

2.4.1 固定化載體的優(yōu)化 從表2看出,樹脂法吸附性差,不能將 PPO很好地吸附,因此不能將 PPO固定化;采用殼聚糖微球固定法將 PPO固定化,吸附能力過強,通透性也差,固定化酶活性也隨之下降;以硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法比殼聚糖微球固定法的效果好,能將 PPO很好地固定。

表 2 不同載體的固定化多酚氧化酶活力

分別往適量的硅藻土中加入 PPO 4mg和磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)1mL,混合均勻,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度 0.1%(體積分數(shù)),30℃下交聯(lián) 8h,過濾洗滌,洗去游離酶和殘余的戊二醛,加入質(zhì)量分數(shù) 4%海藻酸鈉,混合均勻,用注射器滴入質(zhì)量分數(shù) 2%的氯化鈣溶液中,立即可以見到小球形成,且由透明變成白色并沉淀,用濾紙濾出小球體,并用相同的 CaCl2溶液浸泡 2h左右固定化,濾出小球體,操作完畢后,移入 4℃的冰箱中硬化 2h,然后用蒸餾水洗滌,加入戊二醛溶液交聯(lián) 4h,再用蒸餾水洗滌,得到固定化酶。

2.4.2 硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法固定 PPO條件的優(yōu)化

2.4.2.1 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響 從圖 4可以看出,海藻酸鈉濃度低時,酶泄漏嚴重,清洗固定化酶小球時,酶的損失較多,酶活力下降,酶活力隨海藻酸鈉濃度的增大而提高,當海藻酸鈉濃度達到質(zhì)量分數(shù) 0.4%時,酶活力達到最大值,之后酶活力略有下降,可能是固定化酶負載量過大,使得載體強度不夠,酶反而容易泄露。加上海藻酸鈉濃度高時,微環(huán)境效應(yīng)和擴散阻力對反應(yīng)影響更大,且不易操作,很難將酶液從注射器中擠出。故選用質(zhì)量分數(shù) 0.4%海藻酸鈉對酶進行固定化較為適宜。

圖 4 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響

2.4.2.2 固定化時間對固定化酶活性的影響 固定化時間對固定化酶活力的影響如圖 5所示,可以看出,當固定化時間為 2h時,固定化酶活力最高,固定化時間過短或過長,固定化酶活力均有不同程度的下降。究其原因,固定化酶的活性受到兩個方面的綜合影響,一方面隨著固定化時間的延長,多酚氧化酶固化越來越充分,酶在海藻酸鈣凝膠中包埋得更牢固,有利于固定化酶活力的提高;另一方面,隨著固定化時間的延長,Ca2+對固定化酶的抑制作用加劇,使酶活力下降。

圖 5 固定化時間對固定化酶活性的影響

2.4.2.3 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響 實驗結(jié)果如圖 6所示,在實驗范圍內(nèi),交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響較小,固定化酶交聯(lián)不同時間后,其相對酶活力均在 75%以上,交聯(lián)時間為 4h時,固定化乳酸氧化酶相對酶活力最高,交聯(lián)時間過長或過短,酶活力均有所下降。這可能是因為分子間交聯(lián)反應(yīng)達飽和后,隨著時間的延長,開始發(fā)生酶分子內(nèi)交聯(lián),增加了酶分子間的空間位阻,直接影響到酶活性中心對底物的定位作用。且內(nèi)擴散阻力也增大,從而使固定化后有部分酶蛋白失活。

圖 6 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響

2.4.3 固定化酶的酶學性質(zhì)

2.4.3.1 pH對固定化酶活性的影響 酶存在于生物體中,具有很高的催化活性。但是它對于所處的微環(huán)境也有很高的要求。例如溶液的酸堿性對于酶的活力具有很大的影響。我們實驗了在不同的 pH條件下,液相以及固定化多酚氧化酶的活力,所得結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對固定化和游離 PPO活性的影響

由圖 7可以看出,固定化酶的最適 pH為 6.0,與游離酶相比,其最適 pH發(fā)生了變化,由 7.0變?yōu)榱?.0。固定化酶的最適 pH較游離酶的最適 pH發(fā)生了偏移,可能由于兩種因素造成：一是載體含有大量帶電基團,其多電解質(zhì)的微環(huán)境影響著酶的活力;二是由于酶的作用產(chǎn)物導致在固定化酶顆粒內(nèi)建立一種帶電的微環(huán)境。

2.4.3.2 溫度對固定化酶活性的影響 不同酶的熱穩(wěn)定性不同。在溫度低于最適反應(yīng)溫度時,酶反應(yīng)速度隨著溫度的升高而增加,這時酶蛋白的熱變性不是主要的;在溫度超過最適溫度時,反應(yīng)速度反而會隨著溫度的升高而下降,這時酶熱變性造成的影響比升溫引起反應(yīng)加速的影響更大。固定化多酚氧化酶最適反應(yīng)溫度曲線和熱穩(wěn)定性曲線分別如圖 8和 9所示。

圖8 溫度對固定化和游離 PPO活性的影響

圖9 固定化和游離 PPO的熱穩(wěn)定性

圖 8中相對酶活指不同溫度條件下,加入等量酶液或固定化酶反應(yīng)的表觀酶占其中最大值的百分比。游離酶的活力隨著溫度的上升迅速增大,到達40℃左右達到最大,說明游離酶的最佳反應(yīng)溫度在40℃。固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為 50℃。游離和固定化酶在 40℃之前保持著良好的熱穩(wěn)定性,但是溫度到達 60℃時,游離酶的活力損失嚴重,而固定化酶仍然保持著較高的酶活力。由此可見,固定化酶對溫度的敏感度降低,溫度變化對固定化酶酶活力的影響不大。

3 結(jié)論

通過對多酚氧化酶性質(zhì)的研究,結(jié)果表明：用掃描電鏡觀察經(jīng)過分離純化的桑葉多酚氧化酶,其為纖維狀蛋白,分子長度在 4～12μm之間,寬度在0.5～1.5μm之間。桑葉多酚氧化酶的分子量約為47kDa;最適底物為焦性沒食子酸;最適 pH為 7.0;最適溫度為 40℃。PPO的 Km值為 0.093mol/L。

研究了桑葉多酚氧化酶的固定化：用濃度質(zhì)量分數(shù)為4%海藻酸鈉、體積分數(shù)0.2%戊二醛、0.2mol/L的CaCl2固定多酚氧化酶,固定時間 2h,交聯(lián)時間 4h,能使固定化多酚氧化酶的活力達到最大。固定化酶的最適 pH為 6.0,固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為 50℃,固定化酶對溫度的敏感度降低,溫度變化對固定化酶酶活力的影響不大。

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Study on the immobilization of polyphenol oxidase of mulberry leaf

YANG Yang1,HUANG Tao2,GUAN Hong-yan2,W U X iao-yu1
(1.College ofLife Science and Technology,Nanning 530004,China; 2.College ofLight Industry and Food Engineering.,GuangxiUniversity,Nanning 530004,China)

Kine tic cha rac te ris tics of p olyp henol oxidase(PPO)in m ulbe rry leaf we re s tud ied.The result showed tha t the op t im um pH and temp e ra ture was7.0and40℃,resp ec tive ly,and the M ichae liscons tant was0.093m ol/L.The imm ob iliza tion of PPO from m ulbe rry leaf was resea rched.The ac tivity of imm ob ilized PPO reached its m ax im um when4% sod ium a lg ina te,0.2% g luta ra ldehyde,0.2m ol/Lwe re used to imm ob ilize the PPO,in an mim ob iliza tion t im e of2h and c ross linking t im e of4h.The op t im um pH and temp e ra ture was6.0,and 50℃resp ec tive ly,and the enzym e becam e less suscep tib le to the temp e ra ture,the temp e ra ture d id little affec t to the enzym a tic ac tivity.

m ulbe rry leaf;p olyp henol oxidase;kine tics; imm ob iliza tion

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0245-05

多酚氧化酶是遍布動植物體內(nèi)的一種胞內(nèi)酶,在植物體內(nèi)主要與抗病等有關(guān)[1-2];在食品保鮮方面,多酚氧化酶(PPO)與果蔬的褐變、黑色素合成有關(guān),它可以氧化多酚成醌,使產(chǎn)品顏色變深,并使風味產(chǎn)生一定變化;PPO與昆蟲的發(fā)育有密切關(guān)系,可以通過研究它開發(fā)殺蟲農(nóng)藥[3]。PPO能促使兒茶素類物質(zhì)氧化形成茶黃素、茶紅素和其它的氧化聚合物,同時伴隨兒茶素的氧化,氨基酸、胡蘿卜類等香氣前體發(fā)生偶聯(lián)氧化,產(chǎn)生各種各樣的香氣化合物,并形成紅茶的基本風味[4]。由于 PPO潛在的應(yīng)用背景及對人體健康的影響和環(huán)境保護方面的因素,故對它的研究具有廣泛的理論意義和實際應(yīng)用價值。人們做了很多的關(guān)于多酚氧化酶的研究工作,其中最受關(guān)注的問題集中在不同介質(zhì)及不同溫度、不同條件下的多酚氧化酶的活性研究。但對于桑葉多酚氧化酶的固定化研究尚未見報道。桑樹是我國重要的經(jīng)濟作物,桑葉不僅是家蠶的最好飼料,而且桑葉和桑根等又自古入藥[5-6]。為此,本文以桑葉 PPO為研究對象,研究桑葉 PPO酶學性質(zhì)和固定化,為桑葉PPO的亞細胞定位及進一步開發(fā)利用桑樹資源和桑葉多酚氧化酶的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

2009-03-23

楊洋(1956-),女,教授,研究方向：天然植物生物活性研究。