陳毅堅(jiān),鐘文武,余正云

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650031; 2.西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南西雙版納 666100)

食用塊菌形態(tài)特征和抗氧化性能研究

陳毅堅(jiān)1,鐘文武1,余正云2

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650031; 2.西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南西雙版納 666100)

對(duì)產(chǎn)于云南的塊菌的形態(tài)特征進(jìn)行了研究,觀察了子實(shí)體、子囊孢子的形態(tài),并將塊菌的水提取液和醇提取液進(jìn)行了清除DPPH自由基、清除超氧負(fù)離子自由基、清除羥基自由基的抗氧化性能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,塊菌有大而壁厚的子囊孢子,人工培養(yǎng)時(shí)不易萌發(fā)。塊菌的水提取液和醇提取液都有較好的抗氧化性能,醇提取液的抗氧化性能優(yōu)于水提取液。

塊菌,共生型真菌,形態(tài)特征,抗氧化性能

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

云南塊菌 購(gòu)自匯和公司,標(biāo)本經(jīng)鑒定后儲(chǔ)存于云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室;云南塊菌不同溶劑提取物 a.蒸餾水提取液 (將10g塊菌子實(shí)體切碎,加入 50mL蒸餾水,沸水浴加熱20min,過(guò)濾備用);b.50%醇提取液 (將 10g塊菌子實(shí)體切碎,加入 50mL 50%的乙醇溶液,室溫下浸泡一周,過(guò)濾備用);c.95%醇提取液 (將 10g塊菌子實(shí)體切碎,加入 50mL 95%的乙醇溶液,室溫下浸泡一周,過(guò)濾備用);鮮松針培養(yǎng)基 洋芋 20%、鮮松針 3%、麥芽糖1%、葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、MgSO40.05%、瓊脂 2%;PDA培養(yǎng)基 200g馬鈴薯、葡萄糖10～20g、瓊脂 17～20g、水 1000mL;鄰二氮菲,H2O2, FeSO4,磷酸鹽緩沖液,Tris-HCl緩沖液,鄰苯三酚, DPPH。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 塊菌生境和形態(tài)描述[12]通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料了解塊菌的生態(tài)環(huán)境特征;觀察描述子囊果特征和徒手切片法制子囊孢子顯微玻片觀察其形態(tài)特征和生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 分離培養(yǎng)

1.2.2.1 塊菌組織塊接種培養(yǎng) 將塊菌子實(shí)體用70%酒精泡洗數(shù)次,再用無(wú)菌水沖洗數(shù)次,切成 0.5～1.0cm大小,接種于鮮松針和 PDA固體培養(yǎng)基上,于28℃的溫箱中培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)狀況。

1.2.2.2 孢子懸浮培養(yǎng) 將用石英砂研磨塊菌子實(shí)體后離心得到的孢子懸液分別接種于鮮松針液體培養(yǎng)基(pH=7.2～7.4)和 PDA液體培養(yǎng)基 (pH=7.2～7.4)中懸浮培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速 120r/min,23～25℃,培養(yǎng)一周后定期進(jìn)行鏡檢,觀察其生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 塊菌提取液抗氧性能的研究

1.2.3.1 提取液清除DPPH·的實(shí)驗(yàn)[13-14]配制塊菌水提取液,50%乙醇提取液,95%乙醇提取液備用,同時(shí)配制 0.0177mmol/L的 DPPH溶液,避光保存?zhèn)溆?。分別取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL不同溶劑提取的提取液于試管中,加 2mL所配制的DPPH溶液,混合均勻,補(bǔ)充體積至 4mL,30min后倒入光徑為1cm的比色皿中,在 517nm處測(cè)定其吸光度值,同時(shí)測(cè)定提取液樣品空白以及不加提取液的空白樣的吸光度值。按下式計(jì)算其對(duì)DPPH的抑制率：

抑制率 (%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

其中：Ai=2mL DPPH溶液 +提取液的吸光度值;Aj=2mL提取液 +2mL乙醇的吸光度值;A0= 2mL DPPH溶液 +提取溶劑的吸光度值。

1.2.3.2 提取液清除超氧負(fù)離子自由基的實(shí)驗(yàn)[15]取 5.6mL Tris-HCl緩沖液于試管中,加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL的提取液混勻后,25℃的水浴鍋中保溫 10min,取出后立即加入在 25℃水浴鍋中預(yù)熱的鄰苯三酚 0.3mL,迅速搖勻,倒入光徑為 1cm比色皿,每隔 30s測(cè)定吸光度 1次,平行測(cè)定 3次,取平均值,計(jì)算抑制率,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

抑制率(%)=(A樣-A0)/A0×100%

1.2.3.3 提取液清除羥基自由基的實(shí)驗(yàn)[16]在試管中分別加入 2mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液,1mL 1.5mmol/L的鄰二氮菲溶液,充分混勻后加入 1mL 1.5mmol/L的 FeSO4溶液,加入后立即混勻,分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL的提取液,混勻后再加入 1mL 0.02%～0.03%的 H2O2,最后補(bǔ)充體積至8mL,同時(shí)做樣品空白和試劑空白 (A0),于 37℃保溫1h,測(cè)定 510nm下的吸光度,重復(fù) 3次,計(jì)算平均值。

OH-的清除率 (%)=(A樣-A0)/A0×100%

式中：A樣為提取液并扣除樣品空白后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 塊菌生態(tài)環(huán)境特征及形態(tài)特征

實(shí)驗(yàn)材料采自云南楚雄永仁,塊菌子實(shí)體生于云南松 (Pinas yunnanensis)、高山松 (Pinas densata)、麻 櫟 (Quercus acutiss im a)、高 山 櫟 (Quercus sem icarpifolia)、青岡櫟 (Cyclobalanopsis glauca)的混交林下土層中,土質(zhì)疏松微砂?；?、瘠薄,含少量的腐殖質(zhì),平均氣溫 18～20℃,每年 11至次年 2月為采收期。

云南塊菌的子囊果 (子實(shí)體)多呈球形或半球形,直徑 1.5～3.5cm,單重 5.8～11.7g,黑褐色,表面布以大小不等的疣突,放置時(shí)發(fā)出濃郁的香甜氣味,子囊果質(zhì)硬,較耐儲(chǔ)存,采收后可埋于干沙中一段時(shí)間。切開子實(shí)體可見(jiàn)一些乳白色的菌脈,制徒手顯微切片觀察可見(jiàn)塊菌的子囊較大,一般含有 2、3或 4個(gè)孢子,子囊孢子橢圓形,大小為 32～48×21～35μm,褐色,表面有較多的突起,有較厚的孢子壁,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 菌子囊及子囊孢子(a～d)和菌在液體培養(yǎng)液中孢子的生長(zhǎng)狀態(tài)塊(e、f)

2.2 分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)比較塊菌組織塊接種培養(yǎng)和孢子分離培養(yǎng)的結(jié)果,可見(jiàn)塊菌組織塊在固體培養(yǎng)基上不易生長(zhǎng),培養(yǎng)物極易被污染,這與塊菌為共生菌有關(guān)。而孢子分離懸浮于松針培養(yǎng)基中培養(yǎng)的有絮狀沉淀產(chǎn)生,鏡檢觀察后,發(fā)現(xiàn)有無(wú)性孢子產(chǎn)生,直徑大小為8～11μm。

2.3 塊菌提取液抗氧化性能的研究

2.3.1 塊菌提取液清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn) 用不同溶劑的塊菌提取液做清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn),依據(jù)公式計(jì)算出抑制率,不同溶劑不同濃度提取液的清除效果見(jiàn)圖2。

由圖 2可知,塊菌水提取液和 95%的乙醇提取液對(duì) DPPH自由基有較好的清除效果 (最高值達(dá)80%),隨著濃度的增加清除率也在增加;且在低濃度的范圍內(nèi),清除率的增加幅度較大,當(dāng)濃度增加到一定時(shí),清除率增加不明顯。50%的乙醇提取液對(duì)DPPH自由基的清除效果相比而言明顯低于水提液和 95%乙醇提取液的清除效果。

圖2 塊菌不同溶劑提取液清除DPPH·結(jié)果示意圖

2.3.2 塊菌提取液清除超氧負(fù)離子自由基的實(shí)驗(yàn)不同溶劑塊菌提取液清除超氧負(fù)離子自由基的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 塊菌不同溶劑提取液清除超氧負(fù)離子自由基結(jié)果示意圖

由圖 3可知,塊菌 50%乙醇提取液對(duì)超氧負(fù)離子自由基幾乎沒(méi)有清除效果,而在水提液和 95%乙醇提取液中,95%的乙醇提取液對(duì)超氧負(fù)離子自由基的清除效果較好,在較低濃度下,清除率增加的幅度較小,而隨著濃度的增加,清除率也明顯增大。實(shí)驗(yàn)表明,水提取液和 95%乙醇提取液對(duì)超氧負(fù)離子自由基的清除能力為：95%乙醇提取液 ＞水提取液。

2.3.3 塊菌提取液清除OH自由基的實(shí)驗(yàn) 塊菌不同溶劑提取液清除羥基自由基的結(jié)果見(jiàn)圖 4。

圖 4 塊菌不同溶劑提取液清除OH·自由基結(jié)果示意圖

由圖 4可知,塊菌水提取液、50%乙醇提取液和95%乙醇提取液對(duì)羥基自由基都有較好的清除效果(最高值達(dá) 80%以上),在較低濃度下清除率增加幅度較大,而在較高的濃度下,清除率增加不明顯。95%和 50%的乙醇提取液在加入體積 0.5mL時(shí)有相同的抑制率。

3 討論

通過(guò)觀察塊菌的子囊果的孢子的形態(tài)特征可以得知,塊菌的子囊孢子有較厚的孢子壁,普通的固體培育法不易使孢子萌發(fā),懸浮培養(yǎng)時(shí)孢子易萌發(fā),因此提示我們,采用人工和半人工模擬栽培時(shí)可使用懸浮培養(yǎng)的孢子懸液作為接種劑可取得較好的效果。

通過(guò)塊菌不同溶劑提取液抗氧化性能不同測(cè)定方法的比較研究,可看出不同溶劑的塊菌提取物都有較好的抗氧化效果,而醇溶劑的提取物效果較好,因此對(duì)塊菌的食用加工方面,可制作出保健酒或酒精飲料等產(chǎn)品,以提高塊菌資源利用的附加值。在今后的進(jìn)一步研究中,將對(duì)塊菌活性成分進(jìn)行深入的研究,可將其活性成分提取純化出來(lái),并鑒定其結(jié)構(gòu),用做其它食品或化妝品的添加物,還可開發(fā)為抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫功能的藥物等,這將對(duì)我省塊菌資源的可持續(xù)利用和天然抗氧化劑的開發(fā)有著積極的作用。

[1]魏景超 .真菌鑒定手冊(cè)[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1978：274-277.

[2]弓明欽,王鳳珍,等 .我國(guó)的塊菌資源及其利用前景[J].林業(yè)科學(xué)研究,2000(增刊)：173-179.

[3]JinMing Gao,An Ling Zhang,Chen YingWang,et al.A New Ceramide from the AscomyceteTuber indicum[J].Chinese ChemicalLetters,2002,13(4)：325-326.

[4]陳應(yīng)龍,弓明欽 .塊菌資源多樣性及其地理分布[J].中國(guó)食用菌 2000(6)：6-7.

[5]劉洪玉,陳惠群,李子平,劉德中 .塊菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其開發(fā)利用[J].資源開發(fā)與市場(chǎng) .1997(13)：260-262.

[6]徐阿生 .西藏塊菌屬的分類研究[J].菌物系統(tǒng),1999,18：361-365.

[7]陳應(yīng)龍 .塊菌生態(tài)生理學(xué)研究[J].中國(guó)食用菌,2001,20 (5)：28-30.

[8]王元,李子平 .中國(guó)塊菌屬一新種[J].真菌學(xué)報(bào),1991,10 (4)：263-265.

[9]常明昌,陶愷 .珍稀名貴的食用菌一塊菌[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),1989(4)：10-1.

[10]Jin Ming Gao,An Ling Zhang,Chen Ying Wang,et al.A New Ceramide from the AscomyceteTuber indicum[J].Chinese ChemicalLetters,2002,13(4)：325-326.

[11]湯亞杰,孔國(guó)平,朱伶俐,等 .塊菌活性成分及其人工栽培研究進(jìn)展[J].中草藥,2007(4)：629-632.

[12]王曉娥 .中國(guó)幾種主要塊菌的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的系統(tǒng)鑒定[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2005.

[13]彭長(zhǎng)連,陳少薇,林植芳,等 .用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)植物抗氧化能力[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2000,27 (6)：658-661.

[14]萬(wàn)素英,趙亞軍,李琳 .食品抗氧化劑[M].北京中國(guó)輕工業(yè)出版社,1998：16.

[15]田益玲,陳冠華,崔同 .動(dòng)力學(xué)分光光度法測(cè)定中藥對(duì)超氧陰離子自由基的清除率[J].光譜學(xué)與光譜分析,2005(4)：138-140.

[16]石玉平,盧挺,王永寧 .油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)清除羥基自由基的研究[J].食品科學(xué),2004,25(11)：300-302.

Study on morphological character and antioxidant activity of edible truffle

CHEN Y i-jian1,ZHONGW en-wu1,YU Zheng-yun2
(1.College of Chemistry and Biological Technology,Yunnan University of the Nationalities,Kunming 650031,China; 2.Xishuangbanna College of Professional Technology,Xishuangbanna 666100,China)

The m orp holog ica l cha rac te r of ed ib le truffle was s tud ied through the obse rva tion of fruiting body and ascosp ore in this p ap e r,and its antioxidant ac tivity was a lso s tud ied by tes ting c leaning DPPH·free rad ica l, sup e roxide rad ica l and hyd roxy rad ica lw ith the wa te r extrac t and the a lcohol extrac t of truffle.The result showed tha t truffle ascosp ore had la rge and thick wa ll,which p revented from its ge rm ina tion in a rtific ia l culture.The wa te r extrac t and the a lcohol extrac t of truffle both have be tte r antioxidant ac tivity,and the a lcohol extrac t is sup e rior to the wa te r extrac t in antioxidant ac tivity.

truffle;sym b iotic fungus;m orp holog ica l cha rac te ris tic;antioxidant ac tivity

TS219

A

1002-0306(2010)02-0139-03

塊菌是真菌綱 (Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、塊 菌 目 (Tuberales)、塊 菌 科(Tuberaceae)、塊菌屬 (Tuber)[1]的外生菌根型真菌。迄今全球描述的塊菌屬真菌在 60種以上,主要分布在北溫帶的森林地區(qū)和南溫帶的森林地區(qū),少數(shù)分布在干旱的荒漠、半荒漠地帶和亞熱帶林區(qū)。歐洲地區(qū)是塊菌的發(fā)祥地,法國(guó)、意大利、西班牙等為塊菌的主要分布區(qū)。塊菌在中國(guó)主要分布在西南的四川和云南,海拔 1600～2600m的針闊混交林或針葉林下,以及西北的新疆和西藏等地[2]。到目前為止,在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的塊菌種類估計(jì)有 25種之多。塊菌有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多種藥物功能,近年來(lái)有很多的研究報(bào)道其所含活性成分有α-雄烷醇、神經(jīng)酰胺、塊菌多糖等,這些化合物具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗衰老等活性,塊菌的這些良好保健作用也因此受到了人們的關(guān)注[3-11]。但由于塊菌是菌根共生型真菌,有特殊的生境要求,故產(chǎn)量少,目前出口需求量大,我們?cè)颇鲜〉囊恍┵Q(mào)易公司每年都向產(chǎn)地收購(gòu)后直接出口歐洲國(guó)家,對(duì)塊菌資源的利用較粗放,這不利于資源的保護(hù)和有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的利用。本文開展對(duì)塊菌的生物學(xué)特性和抗氧化性能的比較研究,為探究塊菌抗衰老、保肝健體的機(jī)理,也為今后更好地利用塊菌資源,開發(fā)附加值較高的保健產(chǎn)品提供基礎(chǔ)資料。

2009-03-10

陳毅堅(jiān)(1966-),女,副教授,研究方向：微生物資源的開發(fā)和利用。