沈 晗,孫寶國(guó),廖永紅,肖 陽(yáng)

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048)

豬肉復(fù)合酶解及其熱反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析研究

沈 晗,孫寶國(guó),廖永紅＊,肖 陽(yáng)

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048)

比較 14種蛋白酶酶解豬肉水解度大小與其熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味,篩選出水解度較大,風(fēng)味較好的 Trypsin、Papain、Neutrase(powder)、Novozymes Flavorase、Novozymes Protamex、Alcalase 2.4L、Protex6L酶進(jìn)行L18(37)正交實(shí)驗(yàn),得水解度最大的復(fù)合酶組合為A3B3C3D2E3F2G3,其最適酶解條件為加酶量 250U/g豬肉、60℃、自然 pH、2.5h,GC-MS分析酶解物熱反應(yīng)肉味香精揮發(fā)性成分的主要風(fēng)味物質(zhì)為醇類和醛類,其中苯甲醛與糠醛與肉味關(guān)系密切。

蛋白酶,酶解,水解度,熱反應(yīng),GC-MS

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

里脊豬肉 市售;各種蛋白酶制劑 龐博和諾維信酶制劑有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶活力測(cè)定 Folin-酚法[5]。

1.2.2 總氮含量測(cè)定 凱氏定氮法[6]。

1.2.3 游離氨基氮測(cè)定 甲醛滴定法[7]。

1.2.4 水解度 (DH)測(cè)定[8]DH(%)=h/htot×100%

式中：h-水解后每克蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù);htot-每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)。

1.2.5 豬肉酶解 定量稱取豬肉糜 (肉∶水 =2∶1, m/v),用 0.1mol/L的NaOH或 HCl調(diào)至蛋白酶作用最適 pH,添加一定量酶,在最適溫度下的水浴搖床中酶解一定時(shí)間,95℃滅酶 5min,冷卻。

1.2.6 熱反應(yīng) 將一定量還原糖加入豬肉酶解物中,110℃熱反應(yīng) 2h,即得肉味香精,冷卻,編號(hào),待評(píng)價(jià)。

晚上回到家，我對(duì)穎春說(shuō)了縣里地震的事，穎春卻什么也不說(shuō)，只是一個(gè)勁地笑。我覺(jué)得她笑得有些奇怪，便問(wèn)，你笑個(gè)什么鬼喲？穎春點(diǎn)著我的額頭說(shuō)，地震好??！那些人倒臺(tái)了，不是正好給你留下位置了嗎？

1.2.7 肉味風(fēng)味評(píng)價(jià) 選 10個(gè)評(píng)分人,其中 3名為專業(yè)人士,肉味強(qiáng)弱分 10等級(jí),從弱到強(qiáng)分別計(jì)1～10分,打亂樣品順序由評(píng)分人按標(biāo)準(zhǔn)方法單獨(dú)評(píng)分,專業(yè)人士得分權(quán)重占 0.6,其他評(píng)分人得分權(quán)重占 0.4,統(tǒng)計(jì)評(píng)分結(jié)果。

1.2.8 GC-MS分析肉味香精揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì) 取5g肉味香精于 50℃用 SP ME(固相微萃取)法萃取30min,利用 GC-MS對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,其中 GC條件為：柱溫 250℃,不分流,進(jìn)樣量為1.0mL/min,H240.0mL/min,Air 450mL/min,程序升溫起始 50℃,保留 3min,以 6℃/min升至 200℃,保留 2min,再以 10℃/min升至 300℃,保留 2min。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶活力測(cè)定

由于蛋白酶在貯藏過(guò)程中,酶活力逐漸喪失,所以對(duì)收集到的 14種蛋白酶進(jìn)行實(shí)際酶活力的測(cè)定,本實(shí)驗(yàn)酶添加量均按活力計(jì)算。采用 Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活力,結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 14種蛋白酶酶活力測(cè)定結(jié)果

2.2 單一蛋白酶酶解效果與風(fēng)味比較

2.2.1 單一蛋白酶酶解效果比較 將14種蛋白酶分別編號(hào) 1#～14#,按 1.2.5方法在各酶最適 pH、溫度下進(jìn)行豬肉蛋白酶解,酶添加量見(jiàn)表 2。在不同時(shí)間取樣測(cè)定DH,作各酶酶解時(shí)間與DH曲線如圖1。

表 2 1#～14#蛋白酶添加量

在酶的作用下豬肉蛋白逐漸被水解,得到的短肽和氨基酸數(shù)量不斷增加。隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,底物減少,酶解作用減慢,曲線趨于平緩。由圖 1可知：4#酶水解作用最強(qiáng),最大DH達(dá) 46.3%,取 1#、4#、5#、7#、8#、10#、13#、14#酶解作用時(shí)間為 3h,2#、9#、11#酶解作用時(shí)間為 2.5h,3#、6#酶解作用時(shí)間為 2h。

圖 1 1#～14#蛋白酶DH與時(shí)間曲線

2.2.2 單一蛋白酶酶解物熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味比較 將1#～14#酶酶解豬肉蛋白的酶解物按 1.2.6方法進(jìn)行熱反應(yīng),對(duì)其產(chǎn)物風(fēng)味按 1.2.7的方法進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì),將酶解作用的DH大小與對(duì)應(yīng)熱反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味得分比較見(jiàn)圖2。

圖 2 蛋白酶酶解作用的DH與酶解物熱反應(yīng)風(fēng)味得分比較

從圖 2得知,4#、5#、6#、14#酶解作用 DH較大,且對(duì)應(yīng)的熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味較好,而 7#、12#、13#酶解作用DH較小,對(duì)應(yīng)熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味得分卻較高,其它酶酶解作用的DH較低,對(duì)應(yīng)熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味不佳,說(shuō)明獲得較好熱反應(yīng)風(fēng)味產(chǎn)物與酶種類及其DH大小相關(guān)。

2.3 蛋白酶復(fù)合及酶解條件優(yōu)化

不同蛋白酶酶切位點(diǎn)不同,水解度各異,復(fù)合蛋白酶解具有比單一酶更高的酶解效率,不僅 DH大,原料利用率高,而且酶解產(chǎn)物種類多、所得酶解液提供種類和數(shù)量更多的氨基化合物參與Maillard熱反應(yīng),可以獲得更豐富的風(fēng)味物質(zhì)。為了追求原料更高的利用率和良好的風(fēng)味,本實(shí)驗(yàn)選擇 4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶復(fù)合,并進(jìn)行復(fù)合酶解條件優(yōu)化,以獲得最大DH。

2.3.1 蛋白酶復(fù)合配比的確定 將 4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶重新編號(hào)為 A～G,以酶種類為因素、加酶量為水平(見(jiàn)表 3)、DH為指標(biāo)進(jìn)行L18(37)正交實(shí)驗(yàn),其它酶解條件為自然 pH、溫度 60℃、酶解時(shí)間2h,酶解結(jié)果見(jiàn)表 4和表 5。

表3 復(fù)合蛋白酶酶解因素水平表

從表4的R值可以得出,各酶對(duì)DH影響大小的關(guān)系是A＞B＞G＞E＞C＞D＞F。最優(yōu)的復(fù)合酶組合為 A3B3C3D2E3F2G3,該酶組合下實(shí)測(cè) DH為42.88%,比表 4各實(shí)驗(yàn)號(hào)的 DH均大,所以證明該組合選擇正確。雖然最大復(fù)合酶解的DH比 4#單一酶解的DH(46.3%)略低,但復(fù)合酶添加量總和為 250 U/g豬肉,僅不到 4#酶解添加量 (508U/g豬肉)的一半,說(shuō)明復(fù)合酶的酶解效率更高。

表 4 復(fù)合蛋白酶酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 復(fù)合蛋白酶解DH方差分析

2.3.2 復(fù)合酶酶解條件優(yōu)化 對(duì)復(fù)合酶(A3B3C3D2E3F2G3)酶解作用的加酶量、溫度、pH、時(shí)間按表 6所示因素水平進(jìn)行條件優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7和表8。

表6 復(fù)合酶酶解條件優(yōu)化因素水平表

從表7的R值可知,各因素對(duì)DH的影響作用為加酶量 ＞溫度 ＞pH＞時(shí)間,加酶量對(duì) DH的影響顯著,所以繼續(xù)提高加酶量可增大DH。最優(yōu)的復(fù)合酶酶解條件是加酶量為 250U/g豬肉、溫度 60℃、自然pH、時(shí)間 2.5h,該酶解條件下測(cè)定的 DH為 43.11%,比表 8各實(shí)驗(yàn)號(hào) DH均大,說(shuō)明該最適酶解條件正確。

表8 復(fù)合酶酶解條件優(yōu)化DH方差分析

2.4 熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味評(píng)價(jià)及物質(zhì)分析

2.4.1 熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味評(píng)價(jià) 對(duì)復(fù)合酶(A3B3C3D2E3F2G3)在最適酶解條件下的豬肉蛋白酶解物的熱反應(yīng)產(chǎn)物按 1.2.7的方法進(jìn)行風(fēng)味評(píng)價(jià),得分為8.7,產(chǎn)物具有濃郁的豬肉香味,并具有較好的烤香。

2.4.2 熱反應(yīng)產(chǎn)物中風(fēng)味物質(zhì)的 GC-MS分析 采用1.2.8方法中的參數(shù)對(duì)復(fù)合酶解熱反應(yīng)產(chǎn)物中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行 GC-MS分析,得 GC-MS圖譜,見(jiàn)圖 3。收集各峰進(jìn)行檢索,確定風(fēng)味物質(zhì)名稱及峰面積大小,見(jiàn)表 9。

從表 9可知,肉味香精揮發(fā)性風(fēng)味成分中含量最多的物質(zhì)是順式-2,3-氧辛烷、反式-2-戊烯酸乙酯,其次是 3-糠醛、3-環(huán)戊烯-1,2-二醇、苯甲醛等,其中糠醛具有肉香味和烤香味,苯甲醛具有苦杏仁味,具有導(dǎo)致氣味加成或協(xié)同作用的效果,是非常有效的風(fēng)味修飾劑[9],這兩種物質(zhì)與香精肉味有密切的關(guān)系。從物質(zhì)分類上,醇類最多,有 6種,以 3-環(huán)戊烯-1,2-二醇含量最高;其次是醛類,有 5種;其它還有呋喃類、烷烴類、烯烴類等物質(zhì)。

圖3 復(fù)合酶解熱反應(yīng)產(chǎn)物的 GC-MS圖譜

表 9 復(fù)合酶解熱反應(yīng)揮發(fā)性風(fēng)味成分及含量

3 結(jié)論

3.1 不同蛋白酶水解豬肉蛋白的 DH不同,酶解物熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味與酶種類和DH相關(guān)。

3.2 復(fù)合酶具有比單酶更高的水解效率,為了獲得原料最大利用率及較好的熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味,需使酶解作用的DH最大化。對(duì)蛋白酶進(jìn)行復(fù)合得最佳復(fù)合酶組合為 A3B3C3D2E3F2G3,其酶解最適條件為加酶量 250U/g豬肉、60℃、自然 pH、2.5h,DH達(dá)43.11%。

3.3 對(duì)復(fù)合酶酶解豬肉蛋白熱反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行 SP ME -GC-MS分析,得其主要的風(fēng)味物質(zhì)為醇類和醛類,與肉味具有較大關(guān)系的風(fēng)味物質(zhì)是 3-糠醛、苯甲醛等。

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Study on hydrolysis of pork enzymatic hydrolysis by complex proteases and analysis of the volatile components ofMaillard reaction products

SHEN Han,SUN Bao-guo,L IAO Yong-hong＊,XIAO Yang
(School of the Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China)

By comp a ring the DH and tas te of the14p roteases hyd rolyza tes of p ork p rote in,Tryp s in,p ap a in,neutra l p rotease,Novozym e flavourzym e,Novozym e p rotam ex,a lca lase2.4L and p rotex6L we re se lec ted to be tes ted in orthogona l exp e r im ent.The bes t com b ina tion of the b igges t DH was A3B3C3D2E3F2G3,its op t im um cond ition was p rotease quantity250U/g p ork,60℃,na tura l pH,2.5h.M a illa rd reac tion p roduc ts we re ana lyzed by GC-MS,the flavor subs tances which m a inly we re a lcohol,a ldehydes and so on,furfura l and benza ldehyde had a c lose re la tionship w ith the p orc ine flavor.

p rotease;enzym a tic hyd rolys is;DH;M a illa rd reac tion;GC-MS

TS251.1

A

1002-0306(2010)02-0104-04

肉是人類的重要食物,肉香味是人類飲食中最重要的香味之一,熱反應(yīng)是肉味香精形成的最主要的途徑之一[1]。通過(guò)蛋白酶酶解肉蛋白可以獲得很多肉味前體物質(zhì),如游離氨基酸、胺、多肽等[2],這些氨基化合物與羰基化合物可進(jìn)行羰氨反應(yīng)(Maillard熱反應(yīng),后簡(jiǎn)稱熱反應(yīng)),產(chǎn)生醛、酮、酯類等具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)[3]。蛋白酶分內(nèi)切酶和外切酶,不同的蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn),酶解產(chǎn)生的氨基化合物也不同,復(fù)合蛋白酶解不僅使得酶解效率大大提高,而且提供更多不同種類和數(shù)量的氨基化合物,通過(guò)熱反應(yīng)產(chǎn)生性質(zhì)和種類不同的風(fēng)味物質(zhì),形成不同的風(fēng)味。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較 14種蛋白酶的水解度(DH)與酶解產(chǎn)物熱反應(yīng)產(chǎn)生肉風(fēng)味的強(qiáng)弱篩選出 7種蛋白酶進(jìn)行復(fù)合,并對(duì)復(fù)合蛋白酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò) GC-MS對(duì)酶解物熱反應(yīng)肉味香精風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析[4],比較酶解與風(fēng)味的關(guān)系。

2009-08-07 ＊通訊聯(lián)系人

沈晗 (1985-),男,碩士研究生,研究方向：食品生物技術(shù)。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAK36B05)。