王潔昀,李亞欣,樂國偉,2,林云鑒,施用暉,2,＊

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

微波酸處理對骨膠原蛋白酶解效果的影響研究

王潔昀1,李亞欣1,樂國偉1,2,林云鑒1,施用暉1,2,＊

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

以骨膠原蛋白為原料,采用微波酸處理輔助酶解制備膠原蛋白肽,以水解度及抗氧化能力為指標確定最佳水解條件。通過比較實驗確定最佳微波酸處理條件為：微波功率 510W作用 270s;通過對酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶水解結果比較,確定中性蛋白酶水解產物的水解度及ABTS、DPPH自由基清除率最高;通過單因素實驗及正交實驗優(yōu)化中性酶最佳酶解條件為：酶與底物比10%,底物濃度4%,反應溫度55℃,pH 7.0。結果表明,與單獨酶解相比,微波酸處理能夠使骨膠原蛋白酶解時間縮短 1/2,水解度上升 3.2%,產物的ABTS、DPPH自由基清除率分別提高8.7%和3.1%。

骨膠原蛋白,微波酸水解,酶解,水解度,抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬骨膠原蛋白 實驗室提供;DPPH、ABTS、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶 均購于 Sigma公司;木瓜蛋白酶 龐博生物工程公司;中性蛋白酶 夏盛實業(yè)集團公司;其余試劑 均為國產分析純。

微波爐 松下 NN-S563JF;UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計 尤尼柯 (上海)儀器有限公司; Waters 600高效液相色譜儀 Waters公司;Delta320 pH Meter 梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司; 85-2型恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市通濟儀器廠;DL-5型低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 微波酸處理方法

準確稱取適量骨膠原蛋白,加入一定濃度磷酸溶液,半干狀態(tài)浸潤過夜,放入微波爐中,在設定微波功率及時間條件下水解處理。

1.3 膠原蛋白的水解實驗流程

微波酸處理→冷卻后調解 pH、濃度至酶解條件→加入蛋白酶→控制水解條件進行酶解 →100℃滅酶 10min→5000r/min離心 15min去沉淀→上清液定容→測定水解度、抗氧化活性

1.4 酶解實驗條件

1.4.1 蛋白酶的選擇 選用四種酶在推薦最適條件下水解,實驗條件如表 1所示。

表1 各酶水解膠原蛋白的實驗條件

1.4.2 最佳酶解條件的確定 對選定的最佳蛋白酶水解底物濃度、酶與底物比、水解溫度、pH等因素進行單因素實驗確定最優(yōu)水平,通過正交實驗確定最優(yōu)水平組合。對正交結果進行驗證實驗,并與常規(guī)酶解結果對比,確定最佳水解條件。

1.5 測定方法

水解度 (DH)的測定：采用茚三酮比色法[10]; ABTS+·清除率的測定：采用分光光度比色法,由Roberta Re的方法[11]改進;DPPH·清除率的測定：采用分光光度比色法[12];相對分子質量分布測定：采用HPLC(高效液相色譜)法。

2 結果與分析

2.1 微波酸處理條件對酶解效果影響

微波酸處理過程中不同微波功率和微波作用時間對最終酶解產物水解度的影響見表 2。

表 2 微波功率及作用時間與產物水解度的關系

微波酸處理實際是一種微波預水解的過程,如表 2,最終酶解產物的水解度大小總體上與預處理時的作用時間和微波輻射強度成正比,而在作用時間過長(如 300s)以及功率過大 (如 700W)時有水解度下降甚至蛋白焦糊的情況。這是由于隨著微波輻射強度的提高,體系內分子碰撞加劇、熱量迅速上升,加快了蛋白水解速率;而當微波輻射強度超出一定范圍,體系熱量上升過快,導致膠原蛋白結構受損甚至焦糊。因此,確定微波功率 510W、作用 270s為微波酸處理條件。

2.2 蛋白酶的選擇

在相同底物濃度、酶底比、水解時間下反應,以水解度、ABTS+·和 DPPH·清除率為判斷指標,如圖 1所示,在四種蛋白酶中水解效果最好的是中性酶,因而將中性蛋白酶定為最佳用酶。

圖 1 各酶解產物水解度及自由基清除率比較

2.3 酶解最佳工藝條件的確定

2.3.1 酶與底物比([E]/[S])對酶解效果的影響控制酶解條件為：底物濃度 5%,反應溫度 55℃, pH7.0,時間 3h。圖 2表明,隨著酶濃度的增加,水解度在酶與底物比 2%～6%范圍內上升明顯,6%后由于酶的數(shù)量達到飽和,此時酶的增加對水解速度影響不大,因而水解度變化趨于緩慢?？紤]到酶的利用率與生產成本問題,將酶與底物比的最適范圍定為6%～10%。

圖 2 酶與底物比對酶解效果的影響

2.3.2 底物濃度 ([S])對酶解效果的影響 控制酶解條件為：酶與底物比 5%,反應溫度 55℃,pH7.0,時間 3h。圖 3表明,底物濃度為 4%時水解度達到最高,高于或低于此值均下降。底物濃度過高,體系有效水濃度低,溶液流動性下降,酶與底物發(fā)生有效碰撞的幾率降低,同時過量的底物遮蔽了酶的作用位點;底物濃度過低,酶濃度隨之下降。因此,確定 3%～5%為反應的最適底物濃度。

2.3.3 溫度對酶解效果的影響 控制酶解條件為：酶與底物比 5%,底物濃度 5%,pH7.0,時間 3h。圖 4表明,酶解過程中水解度隨溫度變化明顯。當反應溫度從 40℃升高到 55℃,水解度逐漸升高,55℃時達到最高,60℃時有明顯下降。這說明在適宜的溫度范圍內,酶的活性隨著溫度上升而逐漸升高,而當溫度過高,酶的活性受到抑制,甚至失活。因此,酶解溫度取值范圍為 45～55℃。

圖3 底物濃度對酶解效果的影響

圖4 溫度對酶解效果的影響

2.3.4 pH對酶解效果的影響 控制酶解條件為：酶與底物比 5%,底物濃度 5%,反應溫度 55℃,時間3h。圖 5表明,當反應體系 pH控制在 7.0時的水解度最高,pH6.0～7.0范圍內水解度迅速上升,大于 7.0后逐漸下降。酶活性部位的可解離基團需要在特定的 pH范圍內才能充分解離,此時酶的構象處于活性狀態(tài)。底物蛋白的構象在不同的 pH下也有不同,當pH同時滿足酶和底物的需要,才能使酶的活性中心與底物蛋白最大程度地結合。因此,確定反應 pH范圍為 6.5～7.5。

圖5 pH對酶解效果的影響

2.3.5 酶解最佳工藝條件的確定 由表3結果可知,影響因素的主次順序為 pH＞溫度 ＞底物濃度 ＞酶與底物比。中性蛋白酶的最佳酶解條件為：酶與底物比 10%,底物濃度 4%,反應溫度 55℃,水解液pH7.0。

表 3 正交實驗因素水平表L9(34)

表4 正交實驗結果

2.4 最佳水解條件結果驗證

骨膠原蛋白分別通過中性酶最優(yōu)條件微波酸處理酶解 (微波功率 510W作用 270s,酶與底物比10%,底物濃度 4%,反應溫度 55℃,pH 7.0)以及相同酶解條件下單獨酶解,兩種水解方法下的水解度曲線對比如圖 6所示,3h水解產物水解度、自由基清除率如圖 7所示,相對分子量分布如圖 8所示。

圖 6 中性酶最優(yōu)水解條件下水解度曲線對比

圖7 水解度及抗氧化活性對比

由圖 6可知,經(jīng)微波酸處理后骨膠原蛋白已得到一定程度的水解,酶解過程中快速接近最高水解度,在水解 1.5h時已達到單獨酶解 3h的水平,反應時間縮短一半,最終水解度高于后者,3h后基本平緩,驗證最佳酶解時間為 3h。圖 7結果表明,將膠原蛋白經(jīng)微波酸處理提高了酶解產物的水解度及自由基清除率,水解度上升 3.2%,ABTS+·、DPPH·清除率分別提高 8.7%和3.1%。圖 8表明,兩者的分子量分布趨勢相似,8a圖的分布范圍較寬,分子量在500～1000的肽約占17%,500以下占65%以上;8b圖中分子量在 500～1000的肽約占 22%,500以下約占58%,這與水解度差異相對應。由此說明,微波酸處理對提高骨膠原蛋白的酶解效率及酶解產物的抗氧化活性效果明顯。

圖8 分子量分布對比

膠原蛋白的水解是分子中肽鍵受到破壞而斷裂,生成中間產物最終形成肽的過程。微波酸處理是一種預水解過程,酸可攻擊肽鍵使其斷裂,蛋白質固有頻率 (5×1010Hz)恰好處于微波頻率 (3×108～3×1011Hz)范圍,蛋白質分子交變在電磁場中振動,每個分子的正負電荷都受到交變電場力的作用,造成蛋白質部分降解或空間結構改變,并提高了酸作用的效率并增加了之后加入的酶的作用靶部位,大大縮短水解時間。中性蛋白酶屬于外切蛋白酶,它的水解部位是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水大分子氨基酸的氨基。多種作用方式結合提高了肽鍵斷裂的效率。而肽鏈片段的氨基酸組成、數(shù)量、序列直接影響產物的抗氧化活性,不同水解方式得到產物的抗氧化活性不同,微波酸處理輔助酶解的作用方式提高了具有抗氧化活性多肽的產率。

3 結論

3.1 微波酸處理對膠原蛋白酶解效率的提高具有十分顯著的作用,與常規(guī)單獨酶解方法相比,反應時間縮短一半;相同酶解時間下,水解度及 ABTS+·、DPPH·清除率均高于單獨酶解。

3.2 微波酸處理條件對酶解結果有明顯影響,通過比較實驗確定最佳微波酸處理條件為：微波功率510W,處理時間 270s。

3.3 中性蛋白酶的酶解效果優(yōu)于酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶,其最佳水解條件為：酶與底物比 10%,底物濃度 4%,控制反應溫度 55℃,pH 7.0。產物水解度為20.5%。各因素影響順序為pH＞溫度＞底物濃度 ＞酶與底物比。

3.4 膠原蛋白經(jīng)微波酸處理輔助酶解所得水解產物中分子量在 500～1000的肽約占 17%,500以下占65%以上,具體組成還有待進一步研究。

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Study on effect of microwave-acid treatment on enzymolysis of collagen

WANG Jie-yun1,L IYa-xin1,LE Guo-wei1,2,L IN Yun-jian1,SHIYong-hui1,2,＊
(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.The State KeyLaboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Collagen hyd rolysa te p roduced w ith m ic rowave-ac id trea tm ent p re trea tm ent com b ined w ith hyd rolys is by enzym e.The op t im um technology cond itions we re s tud ied w ith the deg ree of hyd rolys is and antioxidant ac tivity as index.Through the comp a rison tes t,the op t im um cond itions for m ic rowave trea tm ent we re de te rm ined as follows：m ic rowave outp ut p owe r510W,m ic rowave rad ia tion t im e270s.Neutra lp rotease was chosen as the bes t enzym e by the comp a rison of ac id p rotease,p ap a in,neutra l p rotease and a lka line p rotease.The op t im um hyd rolys is technology for enzym olys is w ith neutra l p rotease was confirm ed through the orthogona l tes t：[E]/[S]=10%, [S]=4%,temp re ture55℃,pH7.0.Comp a red w ith conventiona l enzym olys is,the reac ting t im e was shortened by 1/2,deg ree of hyd rolys is inc reased by3.2%,ABTS and DPPH rad ica l scaveng ing ac tivity of hyd rolysa te we re inc reased by8.7%and3.1%resp ec tive ly.

collagen;m ic rowave-ac id hyd rolys is;enzym olys is;deg ree of hyd rolys is;antioxidant ac tivity

TS201.1

A

1002-0306(2010)02-0097-04

膠原蛋白 (collagen)是哺乳動物體內含量最多的蛋白質[1],其類型多、結構復雜,目前已發(fā)現(xiàn) 7個亞類、二十余種不同類型的膠原[2]。膠原蛋白具有共同的特征：由重復出現(xiàn)的 Gly-X-Y肽段以左手螺旋方式形成α肽鏈,每 3條α肽鏈以右手螺旋方式形成穩(wěn)定的三股螺旋結構,即膠原區(qū)域[3]。這些結構特征決定了膠原蛋白具有穩(wěn)定的性質,不易被人體充分消化吸收。將膠原蛋白水解成為膠原多肽,可大大提高其營養(yǎng)價值和吸收利用率,具有保護消化道粘膜、促進骨形成、促進皮膚膠原代謝等生理功能。目前,國內外多采用酶法對膠原蛋白進行水解,由于膠原蛋白本身性質限制,水解時間長,能耗大,產率較低[4-5]。近年來微波輔助反應方法以其快速和節(jié)能的特點已經(jīng)在食品及化學領域中得到廣泛的應用,國內外研究表明,使用微波輔助蛋白質水解可有效提高水解效率及產率,與傳統(tǒng)化學水解及酶解方法相比具有快速、簡便、高效的特點[6-9],而微波酸處理輔助酶解膠原蛋白鮮有報道。本研究將微波輔助酸水解與傳統(tǒng)酶解方法相結合,為膠原蛋白水解效率的提高提供新的途徑。

2009-04-17 ＊通訊聯(lián)系人

王潔昀(1984-),女,碩士研究生,研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學。

863計劃項目(2007AA10Z325);科技部十一五支撐計劃項目(2006BAD27)。