趙海鋒,柴 華,趙謀明,＊,崔 春,王金水

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450052)

擠壓預(yù)處理后小麥面筋蛋白酶解特性的變化

趙海鋒1,柴 華1,趙謀明1,＊,崔 春1,王金水2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450052)

小麥面筋蛋白經(jīng)擠壓預(yù)處理后,利用復(fù)合蛋白酶(Protamex)和木瓜蛋白酶(Papain)酶解。與未擠壓的酶解產(chǎn)物相比較,經(jīng)擠壓預(yù)處理后的酶解產(chǎn)物水解度明顯提高(77%～122%),鮮味明顯增強(qiáng),但蛋白質(zhì)回收率有所下降。擠壓預(yù)處理后的小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物高分子組分減少,低分子組分顯著增加,面筋蛋白酶解液中的鮮味物質(zhì)以小分子肽和游離氨基酸為主。

擠壓預(yù)處理,小麥面筋蛋白,酶解特性,風(fēng)味

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋白 河南蓮花味精集團(tuán);復(fù)合蛋白酶(Protemax) 丹麥諾維信公司;木瓜蛋白酶(Papain) 廣州裕立寶國際有限公司;標(biāo)準(zhǔn)肽樣品GlobinⅢ(分子量 2512)、GlobinⅡ(分子量 6214)、GlobinⅠ(分子量 8519)、GlobinⅠ +Ⅲ(分子量10700)、GlobinⅠ+Ⅱ(分子量 14404)、Globin(分子量 16949),美國 Amersham公司;NaOH、HCl、甲醛 國產(chǎn)分析純。

LC26A型高效液相色譜儀 日本島津公司; KDN-2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司; HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽 上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市宏華儀器有限公司;SPJ-40雙螺桿擠壓機(jī) 陜西得愛食品公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定 采用微量凱氏定氮法,小麥面筋蛋白的換算系數(shù)為 5.7[8]。

1.2.2 氨基氮的測定 酶解液中氨基氮測定采用甲醛滴定法[9-10]。

1.2.3 水解度測定[11]計(jì)算公式如下：

水解度 (DH,%)= [(N2-N1)/(N0-N1)] ×100%

式中：DH-水解度,%;N0-總氮含量,%;N1-酶解前游離氨基酸含量,%;N2-酶解后游離氨基酸含量,%。

1.2.4 蛋白質(zhì)回收率的測定[12]酶解液經(jīng) 4000r/min離心分離 20min,取上清液按半微量凱氏定氮法測定水溶性蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)回收率(PR,%)=(水溶性蛋白含量/原料蛋白含量)×100%

1.2.5 酶解液的分子量分布 采用 Amersham蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng),分離柱為 Superdex-peptide 30/100 GL預(yù)裝柱 (Vt=24.0mL,Vo=8.0mL),進(jìn)樣體積為40μL,檢測波長為 214nm,最大壓力為 1.8MPa,洗脫液為含 0.25mol/L NaCl的 pH7.2磷酸緩沖液,洗脫流速為 0.5mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)肽樣品與洗脫體積擬合直線方程為：

y=-0.0578x+4.6289(R2=0.9960)

其中：y-標(biāo)準(zhǔn)肽分子量的對數(shù);x-是洗脫體積,mL。

1.2.6 氨基酸 (AA)組成分析 樣品酸解后用高效液相色譜 (HPLC)分析,色氨酸則將樣品堿解后用HPLC分析。

氨基酸檢測條件：美國Waters高效液相色譜, PI CO.T AG氨基酸分析柱,溫度為 38℃,流速為1mL/min,檢測波長為 254nm。

1.2.7 感官評定[13]取小麥面筋蛋白酶解液的上清液加入 0.5%NaCl,混合均勻后,置于 60℃水浴中加熱,然后進(jìn)行感官評定。以表 1為標(biāo)準(zhǔn)對各個酶解液進(jìn)行鮮味評分。

表1 鮮味強(qiáng)度分析的標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.3 工藝方法[14]

1.3.1 小麥面筋蛋白擠壓膨化處理 采用干法擠壓,在前期研究的基礎(chǔ)上設(shè)定擠壓機(jī)機(jī)筒溫度為150℃,螺桿轉(zhuǎn)速為 135r/min,模孔孔徑 5mm,物料濕度 20%,以 4±0.5kg/min的喂入量通過擠壓機(jī),當(dāng)擠壓機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定并達(dá)到設(shè)定的溫度后開始收集樣品,樣品放入烘箱中烘干到含水率為 5%,碾磨過 40目篩。

1.3.2 酶解條件及工藝 用于小麥面筋蛋白酶解的酶種類、酶解條件及工藝如下：

Protamex酶解條件：pH6.8,溫度 50℃,酶濃度3500U/g,蛋白濃度 8%,酶解時間 3.0h;Papain酶解條件：pH6.5,溫度 50℃,酶濃度 4000U/g,蛋白濃度6%,酶解時間 4.5h。

小麥面筋蛋白→加水?dāng)嚢琛鷳腋∫骸{(diào)節(jié) pH→水浴中加熱攪拌→達(dá)到最適作用溫度后加入蛋白酶→攪拌酶解→沸水浴中加熱滅酶 (100℃,15min)→冷卻→10000r/min離心15min→測上清液的酶解指標(biāo)

2 結(jié)果與討論

2.1 擠壓預(yù)處理后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物水解度的變化

分別采用 Protamex和 Papain蛋白酶水解擠壓預(yù)處理前后的小麥面筋蛋白,測定其酶解產(chǎn)物水解度,以考察擠壓預(yù)處理前后水解度的變化,結(jié)果見圖 1。

圖 1 擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的水解度

由圖 1可以看出,擠壓預(yù)處理可以顯著提高小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的水解度。擠壓預(yù)處理前后, Protamex和 Papain酶解產(chǎn)物的水解度分別從 6.93%提到 15.39%和從 6.17%提高至 10.94%,分別提高了122%和 77%。這可能是因?yàn)閿D壓預(yù)處理使得小麥面筋蛋白變性,結(jié)構(gòu)變得更為疏松,有利于酶的作用,從而提高了酶解產(chǎn)物的水解度[15]。

2.2 擠壓預(yù)處理后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收率的變化

分別采用 Protamex和 Papain蛋白酶水解擠壓預(yù)處理前后的小麥面筋蛋白,測定其酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率,以考察擠壓預(yù)處理前后蛋白質(zhì)回收率的變化,結(jié)果見圖 2。

表 2 擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物中肽分子量分布

圖2 擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率

由圖 2可知,擠壓預(yù)處理降低了小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率。擠壓預(yù)處理前后, Protamex和 Papain酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率分別降低了7.5%和12.2%。這可能是由于小麥面筋蛋白分子及分子間內(nèi)二硫鍵的形成、酶解產(chǎn)物相互作用、重新聚集的緣故[16]。綜合水解度和蛋白質(zhì)回收率的結(jié)果,Protamex酶解的效果優(yōu)于 Papain酶解效果。

2.3 擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物肽分子量分布的變化

擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白 Protamex和Papain酶解產(chǎn)物肽分子量變化見圖 3。

圖 3 擠壓處理前后小麥面筋蛋白 Protamex(A)和 Papain(B)酶解產(chǎn)物的肽分子量分布

由圖 3可以看出：預(yù)處理前后的面筋蛋白酶解液的肽分子量分布圖譜變化顯著,擠壓后兩種酶解產(chǎn)物中大分子量肽占總肽量比值明顯減少,而小分子量肽占總肽量比值增加,這表明擠壓預(yù)處理后小麥面筋蛋白的結(jié)構(gòu)更適合蛋白酶的酶解。此外, Protamex酶解產(chǎn)物肽分子量分布的較均勻,而 Papain酶解產(chǎn)物肽分子量相對來說更趨向于集中在某一分子段內(nèi),從而說明 Protamex酶能對分子內(nèi)部較多的位點(diǎn)起作用,肽的分子量更小。

由表2中不同酶解產(chǎn)物中各肽段占總肽量的比例可以看出,擠壓預(yù)處理后,Protamex和 Papain酶解產(chǎn)物中分子量大于 5000Da肽段含量顯著降低,分別降低了75.2%和 80.8%,酶解產(chǎn)物中分子量介于 1000～5000Da間肽段則有所增加;分子量 120～1000Da肽段大幅度增加,分別增加了 101.7%和 116.9%。此外,擠壓處理后,面筋蛋白 Protamex和 Papain酶解產(chǎn)物中分子量 ＜120Da的肽段也分別增加了 49.0%和 62.0%。這些結(jié)果說明大部分難以酶解的小麥面筋蛋白組分被降解,原因是擠壓處理導(dǎo)致了小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和重排,而重排后的面筋蛋白結(jié)構(gòu)更有利于酶解[15]。

2.4 擠壓后小麥面筋蛋白酶解液氨基酸組成的變化

小麥面筋蛋白富含谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸,這是小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)不同于其它蛋白的原因之一[17]。蛋白質(zhì)在酶解過程中被降解成多肽、寡肽和游離氨基酸,對呈味有很大貢獻(xiàn)的是酶解產(chǎn)物中的寡肽和游離氨基酸。小麥面筋蛋白富含 Glu,因此酶解液中主要以鮮味為主。二肽也是酶解液中的風(fēng)味物質(zhì),其風(fēng)味特性與氨基酸的組成密切相關(guān)。提供鮮味的二肽中一般都含有 Glu或Asp,如魚蛋白酶解物 Glu-Glu、Glu-Ser、Thr-Glu、Glu-Asp等和酸性肽Gly-Asp、Ala-Glu、Glu-Leu等都具有鮮味的特性[18]。

由圖 3酶解產(chǎn)物肽分子量分布的結(jié)果可知, Protamex酶解液肽的分布更為豐富,于是選擇擠壓預(yù)處理小麥面筋蛋白 Protamex酶解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸及游離氨基酸分析,結(jié)果見表 3。擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白 Protamex酶解液中游離氨基酸含量偏低,分別為 329.85mg/100mL和841.12mg/100mL,僅占全部氨基酸的 5.0%和 14.3%,說明酶解過程中產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物主要以肽為主,但擠壓處理則可以顯著提高游離氨基酸含量。酶解液中游離 Leu和 Phe含量最高,分別為 19.68%和 11.44%,擠壓預(yù)處理使得這兩種游離氨基酸的含量分別降為 14.56%和 9.47%。此外,小麥面筋蛋白的氨基酸中含量最高的 Glu和Pro,在酶解液的游離氨基酸比例中并不占優(yōu)勢。小麥面筋蛋白中鮮味氨基酸預(yù)處理前后分別為50.15%和 51.98%,而酶解液中游離的鮮味氨基酸僅有15.74%,雖說擠壓后的酶解液中游離鮮味氨基酸的比例又下降到 10.85%,但是游離鮮味氨基酸的總量則提高了 40.4%。因此,酶解液中的鮮味氨基酸并未游離出來,有一部分以鮮味肽的形式存在。預(yù)處理后各個氨基酸游離部分與全部氨基酸的比例有所變化,說明擠壓預(yù)處理后酶解位點(diǎn)發(fā)生了改變,有利于更好地進(jìn)行控制性深度酶解。

2.5 擠壓處理后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物風(fēng)味的變化

以表 1為標(biāo)準(zhǔn),對擠壓處理前后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行鮮味評分,結(jié)果見表 4。對兩種不同的酶解產(chǎn)物而言,擠壓預(yù)處理后可以使得酶解產(chǎn)物的鮮味更加突出。結(jié)合表2和表3的分析結(jié)果說明,酶解液中的鮮味物質(zhì)是以小分子肽和游離氨基酸為主。經(jīng)過擠壓處理后,小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物鮮味氨基酸含量的增加,從而達(dá)到了其風(fēng)味閾值,亦或是游離氨基酸之間、氨基酸和小分子肽之間的協(xié)同作用而使得擠壓處理后酶解產(chǎn)物的鮮味更加突出。

表 3 擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成

注：鮮味氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸和絲氨酸之和;括號內(nèi)數(shù)值為單個氨基酸含量占總氨基酸量的百分?jǐn)?shù)。

表 4 擠壓預(yù)處理前后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的鮮味評分值

3 結(jié)論

擠壓預(yù)處理可以顯著改變小麥面筋蛋白的酶解特性。擠壓預(yù)處理后,小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物的水解度提高了 77%～122%,蛋白質(zhì)回收率則下降了7.5%～12.2%;高分子量的肽組分比例顯著減少,低分子量的肽組分比例則明顯增加;氨基酸組成發(fā)生了明顯的變化,游離氨基酸含量顯著增加;酶解產(chǎn)物鮮味增強(qiáng),酶解液中的鮮味成分主要以小分子肽和游離氨基酸為主。因此,擠壓預(yù)處理是一種輔助提高小麥面筋蛋白酶解效率和酶解產(chǎn)物呈味強(qiáng)度行之有效的方法。

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Changes in enzymatic hydrolysis properties of wheat gluten treated with extrusion

ZHAO Ha i-feng1,CHA I Hua1,ZHAO M ou-m ing1,＊,CUIChun1,WANG Jin-shui2
(1.College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450052,China)

The Protam ex and Pap a in-induced hyd rolys is of whea t g luten w ith or w ithout extrus ion trea tm ent we re s tud ied in this p ap e r.Results showed tha t extrus ion trea tm ent resulted in s ignificant inc reases of77%～122% in deg ree of hyd rolys is and in um am i flavor and som ewha t dec rease in p rote in recove ry for whea t g luten enzym a tic hyd rolysa tes.Comp a red w ith na tive whea t g luten hyd rolysa tes,the re la tive p e rcentage of the p ep tides re leased from extruded whea t g luten w ith high and low m olecula r we ight dec reased and inc reased s ignificantly, resp ec tive ly.Results from am ino ac id ana lys is and m olecula r we ight d is tribution of p ep tides sugges ted tha t the flavor comp ounds in resulting hyd rolysa tes m a inly cons is ted of low m olecula r we ight p ep tides and free am ino ac ids.

extrus ion trea tm ent;whea t g luten;enzym a tic hyd rolys is p rop e rties;flavor

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0093-05

小麥面筋蛋白是小麥淀粉生產(chǎn)過程中的一種副產(chǎn)品,是大宗低值食物蛋白資源。小麥面筋蛋白因含有較多的疏水性氨基酸、分子體積及分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大等原因,使得其在水中溶解性差,導(dǎo)致其功能特性無法與其它蛋白競爭,制約了其在食品和非食品領(lǐng)域的應(yīng)用[1-2]。改性尤其是酶解改性是改善小麥面筋蛋白功能特性的核心技術(shù),此外,由于小麥面筋蛋白分子中鮮甜味的氨基酸含量豐富,采用深度酶解技術(shù)制備鮮味特征明顯的呈味基料,是小麥面筋蛋白深加工的一個重要途徑。但小麥面筋蛋白在酶解過程中尚存在一些諸如水解度低、水解速度慢、水解時間長、水解效率低等問題,因此,尋求小麥面筋蛋白高效酶解技術(shù)是小麥面筋蛋白改性的關(guān)鍵。利用雙螺桿擠壓機(jī)對小麥面筋蛋白進(jìn)行擠壓處理,蛋白質(zhì)在高溫、高壓和剪切的綜合作用下,發(fā)生一系列復(fù)雜的物理化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致維持蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)的結(jié)合力變?nèi)?使蛋白質(zhì)分子呈線性定向排列[3],由球狀聚集態(tài)重組為纖維狀,發(fā)生變性,提高酶解敏感性[4]。以前研究多集中在擠壓處理對蛋白質(zhì)功能特性的影響[5-7],而擠壓處理后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物特性的變化尚未見報道,而闡明該機(jī)理對于提高小麥面筋蛋白酶解效率、改善其功能特性具有重要的理論和實(shí)踐意義。因此,本文旨在研究擠壓預(yù)處理后小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物特性的變化,考察擠壓預(yù)處理是否可以提高小麥面筋蛋白的酶解效率和提高酶解產(chǎn)物的呈味能力,為小麥面筋蛋白深加工呈味基料提供理論和方法的指導(dǎo)。

2009-04-13 ＊通訊聯(lián)系人

趙海鋒(1977-),男,講師,博士,研究方向：發(fā)酵工程、食品生物技術(shù)。

國家自然科學(xué)基金 (200676044);國家新技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃(2006AA10Z326)。