周 彬，高 雷，金 堅，陳 蘊，黃 飚，*，趙衛(wèi)國

(1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇無錫214063; 2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無錫214063;3.博陽生物科技(上海)有限公司，上海200000)

納米均相時間分辨熒光免疫法檢測脫氧雪腐鐮刀菌醇方法的建立

周 彬1，高 雷2，金 堅2，陳 蘊2，黃 飚1，*，趙衛(wèi)國3

(1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇無錫214063; 2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無錫214063;3.博陽生物科技(上海)有限公司，上海200000)

目的:利用抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)多克隆抗體，采用納米均相時間分辨熒光免疫法測定技術(shù)(AlphaLISA)建立間接競爭DON定量檢測方法。方法:DON－BSA包被發(fā)光微粒，生物素化羊抗兔抗體與包被有鏈霉素的感光微粒共同構(gòu)成檢測試劑，優(yōu)化檢測條件并評價檢測性能。結(jié)果:該方法的靈敏度為0.007ng/mL，檢測范圍為0.007～100ng/mL，批內(nèi)批間變異系數(shù)均＜5%。不同樣品添加回收實驗:玉米、小麥、啤酒回收率分別為84%～110%、67%～100%、74%～100%。結(jié)論:DON－AlphaLISA是目前DON檢測中最靈敏的方法之一，該分析方法穩(wěn)定性好，可測范圍寬，具有很好的應(yīng)用前景。

脫氧雪腐鐮刀烯醇，生物毒素，納米均相時間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DON人工抗原、抗DON多克隆抗體和DON標(biāo)準(zhǔn)品及DON酶免試劑盒 江蘇省微生物研究所;牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司;親和層析純化的生物素化羊抗兔IgG 洛陽華美生物工程公司;光激化學(xué)感光液、發(fā)光微粒、白色不透明微孔板、AlphaLISA檢測儀 上海博陽生物科技有限公司;檢測樣品購于本地超市;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)品的配制 用樣品稀釋液(10mmol/L，pH7.4的PBS)稀釋DON標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2 間接競爭DON－AlphaLISA方法的建立

1.2.2.1 DON人工抗原包被發(fā)光微粒的制備 在離心管中加入1mg感光微粒，12.5μL 1%Tween－20，0.05mg DON－BSA抗原，10μL硼氫化氰鈉，用0.1mol pH6.0的2－(N－嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補充至200μL，37℃避光反應(yīng)48h。然后加入10μL 0.3mol pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點，37℃避光孵育1h后離心，分離得到已連接DON－BSA的感光微粒，稀釋后備用。

1.2.2.2 樣品處理 稱取谷物樣品或其制品2g，加入10mL蒸餾水，充分振蕩5min后，用微孔濾膜(直徑為0.45μm)過濾，取1mL濾液用1mL蒸餾水稀釋備用。啤酒樣品用蒸餾水比例稀釋后進(jìn)行檢測。谷物及其制品中DON含量(ng/g)=提取液中DON含量×10。啤酒樣品中DON含量為測得值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.2.2.3 檢測步驟 取白色微孔板若干，加入20μL/孔包被有DON－BSA的發(fā)光微粒，加入20μL/孔DON標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，然后加入20μL/孔的DON多克隆抗體，最后加入生物素化的羊抗兔抗體。充分混勻上述各種試劑，37℃溫育，加入包被有鏈霉親合素的感光微粒(100μg/mL)175μL，37℃溫育。在AlphaLISA檢測儀中檢測每孔發(fā)光光子量，根據(jù)光信號的強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品DON的濃度，見圖1。

圖1 均相間接競爭DON－AlphaLISA檢測原理

1.2.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 建立間接競爭 DONAlphaLISA方法，對DON人工抗原－發(fā)光微粒，DON多抗稀釋度，生物素化－羊抗兔抗體稀釋度予以選擇，以達(dá)到最適的測定條件和節(jié)省測定費用。

a.DON抗原－發(fā)光微粒與DON多克隆抗體工作濃度的選擇 取白色微孔板，用反應(yīng)緩沖液將DON抗原－發(fā)光微粒作一系列稀釋:1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，每種濃度1條，最后2孔只加反應(yīng)緩沖液以作空白對照。DON多克隆分別以1∶100，1∶500，1∶1000，1∶5000，1∶10000稀釋，每個濃度2孔/條。按1.2.2.3步驟測定各稀釋度的熒光計數(shù)，統(tǒng)計檢測結(jié)果。

b.生物素化羊抗兔IgG稀釋度的確定 按照已經(jīng)確定的DON抗原－發(fā)光微粒與DON多克隆抗體工作濃度，取白色微孔板，第一條加入20μL DON抗原－發(fā)光微粒，20μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(零濃度點)和20μL抗DON多克隆抗體，第二條加入20μL DON抗原－發(fā)光微粒，20μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和20μL抗體稀釋液(非特異結(jié)合，Nonspecific binding，NSB)。將生物素化羊抗兔 IgG用稀釋液作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800等比例稀釋后分別加入上述板條中，20μL/孔，每個稀釋度兩孔。按1.2.2.3步驟測定各稀釋度的熒光計數(shù)，以熒光計數(shù)為縱坐標(biāo)，生物素化羊抗兔IgG稀釋度為橫坐標(biāo)，繪制曲線。選擇零點熒光計數(shù)高，NSB低的生物素化羊抗兔IgG稀釋度作為工作濃度。

c.反應(yīng)動力學(xué)考察 最適競爭反應(yīng)溫度、時間的確定:按已確定的試劑工作濃度分別加入到白色微孔板中，25℃或37℃條件下，分別溫育10、15、30、45min，給予感光微粒充足的反應(yīng)時間。其他步驟同1.2.2.3，測定不同溫度以及競爭時間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線變化趨勢。連有鏈霉親合素的感光微粒反應(yīng)溫度、時間的確定:按1.2.2.3操作，感光微粒反應(yīng)以不同的溫度:25、37℃溫育，不同的時間:10、15、30、45min，測定零濃度點的熒光計數(shù)。

d.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 由AlphaLISA分析儀直接得到的是各劑量點對應(yīng)的計數(shù)值(CPS)，通過origin軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

1.3 方法學(xué)考核

1.3.1 回收率 稱取玉米、小麥樣品或加有DON標(biāo)準(zhǔn)品的玉米、小麥樣品2g，加入10mL蒸餾水，充分振蕩5min，微孔濾膜(直徑=0.45μm)過濾，取1mL濾液用PBS稀釋備用。通過計算實測值與理論值比值得出回收率。添加不同量的DON標(biāo)準(zhǔn)品的啤酒樣品，經(jīng)比例稀釋后直接檢測。

1.3.2 方法學(xué)的比較 取啤酒樣品若干份，采用DON－AlphaLISA和DON－ELISA進(jìn)行對照實驗。分別用DON－AlphaLISA、DON－ELISA兩種不同的免疫檢測法對16份啤酒和22份玉米樣品進(jìn)行分析，比較不同檢測方法的檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON抗原－發(fā)光微粒與DON多克隆抗體工作濃度的選擇

標(biāo)記DON－BSA以及標(biāo)記成功后復(fù)合物反應(yīng)濃度對建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度有著至關(guān)重要的影響作用。因此選擇合適的稀釋比例是整個實驗成敗的關(guān)鍵。在實驗中深入探討了連有發(fā)光微粒的DONBSA以及抗DON PcAb最佳工作濃度，結(jié)果見表1。

由表1可知，當(dāng)連有發(fā)光微粒的DON－BSA稀釋比為1∶10時，雖然可以得到較高的計數(shù)(接近或大于10000)，但是由于高濃度的發(fā)光微粒導(dǎo)致本底比較高(本底為256);當(dāng)連有發(fā)光微粒的DON－BSA稀釋比為1∶1000時，可以有效的降低本底(本底僅為38)，但數(shù)零點計數(shù)下降明顯(最高計數(shù)為3493)。因此，選擇經(jīng)過適當(dāng)比例稀釋的DON抗原－發(fā)光微粒意義非同尋常，必須滿足保證有效的計數(shù)，同時又可以節(jié)約成本和降低本底。根據(jù)上述要求，稀釋比在1∶100左右較為適合。

選取適當(dāng)?shù)亩嗫節(jié)舛瓤梢蕴岣邫z測靈敏度。對照實驗結(jié)果得出:多抗稀釋比在1∶1000～1∶5000范圍內(nèi)比較適合，既滿足了檢測要求也節(jié)約了試劑用量。

表1 DON－BSA－發(fā)光微粒和抗DON PcAb工作濃度的選擇(熒光計數(shù)(CPS))

2.2 生物素化羊抗兔IgG稀釋度的確定

選擇合適的生物素化羊抗兔IgG稀釋度，既能保證有足夠的量結(jié)合到第一抗體上，又要避免引起非特異計數(shù)(NSB)的增加。在間接競爭 DONAlphaLISA，進(jìn)行第二步反應(yīng)時，抗體稀釋液將生物素化羊抗兔IgG稀釋成不同的濃度，結(jié)果如圖2。

圖2 生物素化羊抗兔IgG稀釋度的選擇

由圖2可知，當(dāng)生物素化羊抗兔IgG的稀釋比不斷加大時，零濃度點的熒光計數(shù)以及NSB均在1∶100稀釋后開始下降明顯，而在1∶200稀釋后，下降趨于平緩。生物素化羊抗兔IgG 1∶100稀釋時，其零濃度點的熒光計數(shù)為1∶50的61.2%，NSB為1∶50的21.78%。所以，選擇1∶100的生物素化羊抗兔IgG作為最佳稀釋濃度。

2.3 不同溫度下的競爭反應(yīng)時間的確定

反應(yīng)溫度分別設(shè)在25、37℃，進(jìn)行時間動力學(xué)的考核。25℃，給予充足的示蹤反應(yīng)時間(生物素與親和素結(jié)合反應(yīng))，測定不同競爭時間下標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 25℃，競爭反應(yīng)時間對DON－AlphaLISA的影響

由圖3可知隨著反應(yīng)時間的延長，各濃度點的熒光計數(shù)逐漸增大，但增幅各不相同，ED50所對應(yīng)的濃度點隨時間延長而減小，曲線靈敏度趨高。競爭反應(yīng)時間30min與45min下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，已無明顯差異。因此，選擇30min為最適競爭反應(yīng)時間。

按照同樣的方法，將反應(yīng)溫度設(shè)為37℃，繪制不同競爭時間下標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖4。按照上述分析原理，此時15min的競爭反應(yīng)時間已經(jīng)得到靈敏度較高的標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，37℃反應(yīng)溫度下，15min為最適競爭反應(yīng)時間。從節(jié)約時間成本的角度考慮，選擇37℃，15min為DON－AlphaLISA競爭反應(yīng)條件。

圖4 37℃，競爭反應(yīng)時間對DON－AlphaLISA的影響

2.4 連有鏈霉親合素的感光微粒反應(yīng)溫度、時間的確定

生物素與親和素可以在較短的時間內(nèi)完成結(jié)合反應(yīng)。在25℃條件下，不同示蹤時間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果見圖5。結(jié)果表明15～30min的反應(yīng)時間基本能夠完成生物素與親和素結(jié)合反應(yīng)。

圖5 25℃，示蹤時間對DON－AlphaLISA的影響

在37℃條件下，不同示蹤時間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果見圖6。反應(yīng)時間為10min時生物素與親和素的反應(yīng)完成一半或許更多。當(dāng)反應(yīng)時間延長至15min已經(jīng)基本完成反應(yīng)。進(jìn)一步延長反應(yīng)時間對提高檢測的靈敏度并無顯著影響。因此，選擇37℃，15min作為示蹤反應(yīng)時間即可。

2.5 DON－AlphaLISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

綜合各項優(yōu)化的結(jié)果，間接競爭 DONAlphaLISA的最適檢測條件為:DON人工抗原－發(fā)光微粒稀釋度1∶100;抗DON PcAb稀釋度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀釋度1∶100;兩步溫育的溫度與時間分別是37℃ 15min和37℃ 15min。間接競爭DON－AlphaLISA的結(jié)果經(jīng)orgin軟件處理所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖7。

圖6 37℃，示蹤時間對DON－AlphaLISA的影響

圖7 均相間接競爭DON－AlphaLISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

以10組標(biāo)準(zhǔn)曲線零濃度點計數(shù)的平均值(ˉX)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以ˉX的計數(shù)減2倍SD所得的計數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)濃度及方法的檢測靈敏度。間接競爭DON－AlphaLISA的靈敏度為0.007ng/mL，檢測范圍為0.007～100ng/mL，IC50為4.84ng/mL。

2.6 添加回收率實驗

已知濃度的DON添加到各樣品中，采用均相間接競爭DON－AlphaLISA方法檢測，各個濃度的檢測結(jié)果見表2。從表2可以看到，平行孔間的CV相對較小，這可能是由于均相檢測的原因，減少人為操作誤差導(dǎo)致的批內(nèi)變異。這一結(jié)果充分說明了檢測穩(wěn)定性較好。整個樣品添加回收率偏低，這可能是樣品處理過程中損失造成的。除了個別樣品，大部分也還在可接受范圍內(nèi)(＜±20%)。

表2 添加回收率測定結(jié)果

2.7 方法學(xué)比較

2.7.1 DON－AlphaLISA和DON－ELISA檢測啤酒和玉米樣品的比較 用本實驗室建立的DONAlphaLISA和DON－ELISA同時檢測16份啤酒樣品，對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖8所示。其 Y=1.05910X－0.5185，相關(guān)系數(shù)為0.9525，表明兩種檢測方法的相關(guān)性很好。由結(jié)果觀察測得值在較低濃度范圍內(nèi)(＜10ng/mL)，DONAlphaLISA測得值略微高于DON－ELISA，而在高濃度范圍內(nèi)又呈現(xiàn)出相反的關(guān)系。導(dǎo)致這樣的結(jié)果，可能是啤酒中存在某些干擾基質(zhì)。

圖8 不同免疫檢測法檢測啤酒樣品的結(jié)果比較

采用本實驗室建立的DON－AlphaLISA試劑盒和DON－ELISA試劑盒檢測22份玉米樣品，對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行對照比較。結(jié)果如圖9所示。其Y=0.0508+1.1591X，R=0.9167，其中兩份樣品由于DON含量低于DON－ELISA檢測限，而DONAlphaLISA的檢測值分別為0.075ng/mL和0.037ng/mL。表明兩種檢測方法的相關(guān)性很好且DON－AlphaLISA檢測方法更靈敏。

圖9 不同免疫檢測法檢測玉米樣品的結(jié)果比較

3 結(jié)論

納米均相時間分辨熒光(AlphaLISA)是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡單的特點。AlphaLISA技術(shù)的核心原理是高能態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為高能態(tài)離子氧，如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受離子氧，并發(fā)出高能級的光(520～620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒，高能態(tài)離子氧就會回落到基態(tài)氧而沒有信號產(chǎn)生［6－7］。

DON－AlphaLISA的測定基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有發(fā)光微粒的DON－BSA加入微孔板，然后順序加入DON標(biāo)準(zhǔn)或樣品、抗DON PcAb、生物素化羊抗兔抗體避光反應(yīng)，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測。包被有發(fā)光微粒的DON－BSA與DON競爭連接到DON抗體，然后與生物素化羊抗兔IgG以及包被有鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體，在特定條件下發(fā)光微粒將信號通過連接在一起的復(fù)合體傳遞給感光微粒產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測光信號，光信號強度與樣品中的DON濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測樣品中DON的含量。

我們建立了均相DON－AlphaLISA免疫檢測法，均相間接競爭DON－AlphaLISA的最適檢測條件為: DON人工抗原－發(fā)光微粒稀釋度1∶100;抗 DON PcAb稀釋度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀釋度1∶100;兩步溫育的溫度與時間均為 37℃15min。DON－AlphaLISA的靈敏度為0.007ng/mL，檢測范圍為0.007～100ng/mL。

DON－AlphaLISA兩步共30min的反應(yīng)模式大大縮短了檢測時間，同時由于免清洗減少了人為誤差，使得檢測結(jié)果的穩(wěn)定性非常好，批內(nèi)、批間變異率＜5%。整個檢測過程可以自動化，方便進(jìn)行大批量檢測。檢測范圍寬達(dá)到0.007～100ng/mL靈敏度和高達(dá)到0.007ng/mL。通常高的靈敏度檢測法常常易受本底干擾。但是在本實驗中并沒有顯現(xiàn)出明顯的基質(zhì)干擾現(xiàn)象(本底＜20計數(shù))。DON－AlphaLISA另一大優(yōu)勢是節(jié)約試劑劑量，檢測樣本量較少僅為20μL/孔。添加回收率實驗結(jié)果表明回收率均值在90%左右，同時CV值較小說明檢測的穩(wěn)定性較好。

［1］Wu F.Mycotoxins risk assessment for the purpose of setting International Regulatory Standards［J］.Environ Sci Technol，2004，38(15):4049－4055.

［2］GB/T 16369－2003.小麥、玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標(biāo)準(zhǔn)［S］.

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Quantitative determination of deoxynivalenol using light initiated chemiluminescence assay

ZHOU Bin1，GAO Lei2，JIN Jian2，CHEN Yun2，HUANG Biao1，*，ZHAO Wei－guo3
(1.Key Laboratory of Nuclear Medicine，Ministry of Health PRC，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine of Jiangsu province，Wuxi 214063，China;2.School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214063，China; 3.Shanghai Boyang Biotechnology Company Ltd.，Shanghai 200000，China)

Objective:An indirect competitive light initiated homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay (AlphaLISA)was established by using anti－DON polyclonal antibody and coating antigen DON－BSA for detection of deoxyhivalenol in cereal.Method:DON－BSA was coated on chenilum inescent particles，the AlphaLISA kit also contained sensitizer particles coated with strep tavidin.The optinal test conditions and analytical performance of the method were studied.Results:Working concentration range from 0.007 to 100ng/mL and the sensitivity for detection was 0.007ng/mL.The intra－and inter－assay CV of the assay were both below 5%.The recoveries of determination for deoxynivalenol spiked in corn，wheat，beer were 84%～110%、67%～100%、74%～100%.Conclusions:This AlphaLISA method is a good method with high sensitivity for quantitative analyzing DON in cereal.

deoxynivalenol;biotoxin;homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay(AlphaLISA)

Q939.91

A

1002－0306(2010)08－0338－05

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，屬于B型單端孢霉烯族毒素，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生。目前，世界范圍內(nèi)DON對谷物的污染居各種生物毒素之首，呈較嚴(yán)重的狀況，而長期暴露于高濃度的DON毒素可導(dǎo)致營養(yǎng)不良，表現(xiàn)不同水平的中毒癥狀，甚至死亡［1］。因此監(jiān)控DON的含量顯得意義重大。我國目前小麥、玉米中DON的限量為1000μg/kg［2］，而部分國家(如奧地利和歐盟等)的限量標(biāo)準(zhǔn)低于我國的限量標(biāo)準(zhǔn)。檢測DON的方法有理化檢測法和免疫化學(xué)法。前者主要包括薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)［3］。后者研究較多的是酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)［4－5］。ELISA檢測法存在標(biāo)記物酶易失活、底物見光易分解、環(huán)境干擾因素復(fù)雜等缺點，且已不能滿足越來越低的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究采用快速高靈敏的納米均相時間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)檢測谷物及其制品中的DON含量。

2009－08－20 *通訊聯(lián)系人

周彬(1981－)，男，研究實習(xí)員，研究方向:食品安全檢測。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)(2008AA10Z415);江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標(biāo)導(dǎo)向課題(SKLFMB－200801)。