駱從艷,慕春海,王園姬,李超鵬,陳文

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

光甘草定的制備及其對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用

駱從艷,慕春海,王園姬,李超鵬,陳文

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

分別選用單酚酶與二酚酶為底物,評(píng)價(jià)硅膠柱層析(CHCl3/MeOH梯度洗脫)分離得到的光甘草定對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)室所分離得到的光甘草定純度為85%以上,其對(duì)蘑菇酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的活性均有抑制作用,導(dǎo)致酶活力下降50%的抑制劑濃度(IC50)分別為1.28μmol/L和1.56μmol/L,且Lineweaver-Burk圖顯示,光甘草定對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)型抑制。光甘草定發(fā)揮著顯著的抑制酪氨酸酶活性,說明光甘草定可以通過抑制黑色素生成的限速酶-酪氨酸酶達(dá)到美白肌膚之功效。

光甘草定;酪氨酸酶;單酚酶;二酚酶;抑制機(jī)理

Abstract:In the present paper,monophenolase and diphenolase are chosen as substrate respectively.The inhibition of tyrosinase is investigated by glabridin which is isolated by the gel silica column chromatography(gradient elution by CHCl3/MeOH).The result was that the purity of glabridin was above 85%.It could inhibit both monophenolase activity and diphenolase activity of the enzyme,IC50 values were 1.28 and 1.56 μmol/L respectively,the kinetic analysis showed that the inhibition of glabridin on the diphenolase activity of the enzyme was reversible and belonged to competitive-type.Glabridin has noticeable inhibitory effects on the tyrosinase,and it has the potential to be further developed into effective skin whitening agent.

Key words:glabridin;tyrosinase;monophenolase;diphenolase;inhibition mechanism

酪氨酸酶(tyrosinase)是皮膚黑色素生物合成的關(guān)鍵酶,它有兩個(gè)主要功能:作為單酚酶,羥基化單酚生成鄰二酚;作為二酚酶,氧化鄰二酚生成鄰醌[1]。抑制酪氨酸酶活性,可改善皮膚中色素細(xì)胞的酪氨酸酶的代謝,阻止色素沉著的形成。天然產(chǎn)物化妝品的開發(fā)越來越受到國內(nèi)外廠商的重視。甘草被稱為“百草之王”,甘草中黃酮類化合物具有抗炎、抗?jié)儭⒖寡趸茸饔肹2],光甘草定是光果甘草中的一種特有的異黃酮成分,目前國內(nèi)外研究顯示光甘草定在調(diào)血脂和降血壓方面具有很明顯的效果[3];除此之外,它在美容行業(yè)也受到越來越多的關(guān)注,Yokota等[4]的研究證明了光甘草定可以降低B16鼠黑素瘤細(xì)胞中 T1和 T3酪氨酸酶同工酶的活性,0.5%光甘草定可以抑制紫外線誘導(dǎo)的豚鼠皮膚色素和紅斑的生成。在國內(nèi)外研究中,尚無光甘草定對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性影響的報(bào)道。

由于不同產(chǎn)地的光果甘草中光甘草定含量不同[5],本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)新疆產(chǎn)光果甘草中光甘草定的含量,并對(duì)其進(jìn)行分離。利用分離得到的光甘草定來評(píng)價(jià)其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用,并探討抑制機(jī)理,以期為皮膚美白劑及新疆光果甘草資源的深入開發(fā)提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

光甘草定對(duì)照品(購于成都普思生物科技有限公司,純度為 99.07%);甲醇、乙腈(色譜級(jí));酪氨酸酶(Worthington公司原裝,1 930 U/mg);左旋多巴(L-DOPA)、L-酪氨酸(Novo公司);二甲基亞砜(DMSO)、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉等均為國產(chǎn)分析純;光甘草定(本實(shí)驗(yàn)室分離,純度85%以上)

美國Waters 600高效液相色譜儀(Waters Delta 600泵,Waters 2996型DAD檢測(cè)器);UV-2401型紫外分光光度計(jì)(日本島津);電子恒溫水浴鍋(DZKW型,北京永光明醫(yī)療儀器廠);Sartorius(BP211D)十萬分之一分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);PHS-3C型p H計(jì)(上海精密儀器有限公司)。

光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)的干燥根及根莖,采于新疆喀什巴楚地區(qū),由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院成玉懷高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為光果甘草。

1.2 方法

1.2.1 光甘草定含量的測(cè)定及分離

色譜條件:采用 KromasilC18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流動(dòng)相:乙腈-2%冰醋酸溶液(p H3)(53∶47),檢測(cè)波長 :280 nm,流速 :1.0 mL/min,進(jìn)樣體積:10μL。

利用硅膠柱層析,洗脫液梯度分別為:CHCl3、CHCl3/MeOH(300∶1)、CHCl3/MeOH(100∶1)、CHCl3/MeOH(50∶1)、MeOH,硅膠薄層板跟蹤點(diǎn)板。最后合并含有光甘草定的餾分,利用高效液相色譜儀檢測(cè)純度。

1.2.2 光甘草定對(duì)酪氨酸酶活力的影響及機(jī)理的探討

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在不加入待測(cè)樣品的情況下,先將1.0 mL 2.5 mmol/L的L-酪氨酸、0.7 mL 1.0 mmol/L的LDOPA(溶于磷酸鹽緩沖溶液p H6.8)置于比色皿中,分別加入 0.4 mL、0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8)混勻,再加入0.1 mL 100U/mL酪氨酸酶水溶液,在475 nm下隔5 min測(cè)定1次吸光度,直至吸光度值不再增加,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)做1條酶活力的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 單酚酶活力的測(cè)定

以2.5 mmol/LL-酪氨酸為底物[6]。先將1.0 mL 2.5 mmol/L的L-酪氨酸(溶于磷酸鹽緩沖溶液pH 6.8)置于比色皿中,加入0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8)混勻,在室溫下放置10 min,加入0.15 mL不同濃度的待測(cè)樣品,混勻后加入0.15 mL 100 U/mL酪氨酸酶水溶液,立即混勻室溫培育25 min后測(cè)定OD475。

1.2.2.3 二酚酶活力的測(cè)定

以1.0 mmol/L L-DOPA為底物[7-8]。先將0.7 mL 1.0 mmol/L L-DOPA(溶于磷酸鹽緩沖溶液pH6.8)置于比色皿中,加入0.1 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8),在室溫下放置5 min,加入0.1 mL不同濃度的待測(cè)樣品,混勻后加入0.1 mL 100 U/mL酪氨酸酶水溶液,立即混勻室溫培育25 min后測(cè)定OD475。

待測(cè)樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率按下式計(jì)算:

式(1)中:OD1是指含有底物、酪氨酸酶、待測(cè)樣品的測(cè)活體系的吸光度值;OD2是指含有底物、酪氨酸酶,但不含樣品的測(cè)活體系的吸光度值;OD3是指含有底物、樣品,但不含酪氨酸酶的測(cè)活體系的吸光度值;OD4是指含有底物,但不含酪氨酸酶、樣品的測(cè)活體系的吸光度值。

固定酶的濃度為100 U/mL,改變底物L(fēng)-DOPA濃度,測(cè)定不同濃度光甘草定對(duì)酶活力的影響,以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,判斷抑制劑的抑制類型[7]。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,比較酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),包括表觀米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(V m)的變化,對(duì)酶的抑制作用機(jī)理進(jìn)行判斷。

數(shù)據(jù)用ˉχ±S表示,采用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 光甘草定含量的測(cè)定及分離

按“1.2.1”項(xiàng)下的洗脫條件檢測(cè),光甘草定得到良好的基線分離。經(jīng)檢測(cè)新疆產(chǎn)光果甘草原料藥中光甘草定含量約為1.57‰。

按“1.2.1”項(xiàng)下的分離方法分離得到純度為85%以上的光甘草定,其 HPLC液相圖譜見圖1。利用本實(shí)驗(yàn)室所分離得到的光甘草定進(jìn)行酪氨酸酶活性影響實(shí)驗(yàn)。2.2 光甘草定對(duì)酪氨酸酶活力的影響及機(jī)理的探討

圖1 光甘草定對(duì)照品及樣品HPLC液相圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and sample of glabridin

2.2.1 酪氨酸酶的活力標(biāo)準(zhǔn)曲線

單酚酶和二酚酶的活力標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

由圖2可以看出,0～20 min內(nèi)酶活性呈增長趨勢(shì),20～25 min酪氨酸酶活性基本穩(wěn)定達(dá)到穩(wěn)態(tài),因此本實(shí)驗(yàn)選擇在25 min時(shí)測(cè)定各個(gè)體系的OD值。

圖2 單酚酶與二酚酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of monophenolase and diphenolase

2.2.2 光甘草定對(duì)蘑菇酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活力的影響

以光甘草定為效應(yīng)物,以L-Tyr和L-DOPA為底物測(cè)定蘑菇酪氨酸酶催化反應(yīng)的進(jìn)程曲線和酶活力曲線,如圖3、圖4所示。

結(jié)果表明,隨著光甘草定濃度的增大,恒定態(tài)斜率下降,說明光甘草定對(duì)蘑菇酪氨酸酶的單酚酶活性有顯著的抑制作用(圖3)。另外,隨著光甘草定的濃度增大,二酚酶穩(wěn)定態(tài)活力顯著下降(圖4),測(cè)定 IC50分別為1.28μmol/L、1.56μmol/L?？梢姽飧什荻▽?duì)酪氨酸酶活性的抑制作用是降低酶的穩(wěn)定態(tài)活力而影響酶的催化作用。

圖3 光甘草定對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制進(jìn)程曲線Fig.3 Progress Curves for the inhibition of tyrosinase monophenolase by glabridin

圖4 光甘草定對(duì)二酚酶穩(wěn)態(tài)活力的影響Fig.4 The dependence of the steady-state rate)

2.2.3 光甘草定對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性抑制機(jī)理的判斷

以光甘草定為抑制劑,測(cè)定其對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制類型,結(jié)果見圖5。其Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖均為相交于1/v軸的一組直線,不管抑制劑濃度如何,這組直線的縱截距不變,仍為1/vmax;但各直線的斜率 Kappm/vmax隨抑制劑濃度的增加而增加,橫截距則隨抑制劑濃度的增加其負(fù)值增加。說明最大反應(yīng)速度(vmax)不隨抑制劑濃度變化,米氏常數(shù)(Km)隨著抑制劑濃度增大而增加,符合競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型的特征。

通過圖5可得到表現(xiàn)米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(vmax),以圖5的直線斜率對(duì)光甘草定濃度作回歸直線,見圖5a。根據(jù)圖5a,由直線在縱軸上的截距除以直線的斜率可以計(jì)算出競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制常數(shù)(K1)為33.17μmol/L。

圖5 光甘草定Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plots of glabridin(a:The relationship of the slope and concentration of glaridin)

3 討論

1)抑制劑對(duì)單酚酶和二酚酶活性的作用不同可能是取決于兩種酶活性所催化的底物分子結(jié)構(gòu)的差異,大多數(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑都與底物有著相似的結(jié)構(gòu)或至少某部分結(jié)構(gòu)相似[9]。光甘草定是光果甘草中一種特有成分,其結(jié)構(gòu)中B環(huán)上2-OH、4-OH,與L-多巴、L-酪氨酸芳環(huán)結(jié)鉤上的-OH相似(圖6中加粗部分),從而易于與酶活中心結(jié)合而對(duì)酶產(chǎn)生抑制。目前,國內(nèi)研究表明甘草素、異甘草素具有抑制酪氨酸酶的活性[10],其在結(jié)構(gòu)上與光甘草定相比,都具有4-OH,但不具有2-OH,故推測(cè)光甘草定之所以具有如此顯著的抑制酪氨酸酶活性的效果,主要是其2-OH所賦予。

圖6 L-酪氨酸、L-DOPA與光甘草定的結(jié)構(gòu)Fig.6 The structure of L-tyrosine、L-DOPA and glabridin

2)由圖5可知,酶與底物結(jié)合的親和常數(shù)1/Km隨光甘草定濃度增大而減小,說明其抑制機(jī)理表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)型效應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑只增加酶-底物結(jié)合的表觀 Km(Kmapp),即抑制劑濃度增加,Kmapp就增加,而 vmax保持不變。說明光甘草定只與自由酶結(jié)合,與L-多巴競(jìng)爭(zhēng)酶活位點(diǎn),把一部分酪氨酸酶從黑色素合成的催化環(huán)中帶走,降低酪氨酸酶在其中的濃度,阻止底物與酪氨酸酶的結(jié)合,從而抑制黑色素的合成?？梢宰鳛闈撛诘拿腊谆瘖y品添加劑。

3)新疆光果甘草資源豐富,主要分布在庫爾勒、阿克蘇、博樂、石河子地區(qū),儲(chǔ)備量比較客觀,有野生和人工栽培資源。但是新疆甘草開發(fā)研究水平較低,對(duì)脂溶性黃酮類成分的開發(fā)利用處于初級(jí)階段,本文的研究結(jié)果為皮膚美白劑提供了有價(jià)值的參考,同時(shí)也為西北光果甘草資源的深入開發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。

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The Isolation of Glabridin and Inhibitory Effect on Activity of Tyrosinase

LUO Congyan,MU Chunhai,WANG Yuanji,LI Chaopeng,CHEN Wen
(College of Pharmacy,Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources,Shihezi 832002,China)

R285.5

A

1007-7383(2010)04-0478-05

2009-10-17

新疆兵團(tuán)重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2009GG47)

駱從艷(1985-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樗幬镄轮苿┡c新劑型。

陳文(1967-),男,教授,從事藥物新制劑與新劑型的研究。