姜新,馮建榮,姜俊卿,王大江,劉月霞

(石河子大學農(nóng)學院,石河子832003)

新疆杏品種自交不親和S-RNase基因PCR擴增體系的優(yōu)化

姜新,馮建榮,姜俊卿,王大江,劉月霞

(石河子大學農(nóng)學院,石河子832003)

以3個新疆杏品種的葉片為試材,以其葉片基因組DNA為模板,分別對 PCR擴增體系中的 10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、Taq DNA聚合酶和退火溫度5個因素設計6個梯度,研究了新疆杏品種自交不親和SRNase基因PCR擴增條件,建立其優(yōu)化的PCR擴增體系。研究結果表明:其擴增程序為94℃預變性5 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個循環(huán)后72℃延伸10 min,25μL反應體系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP 0.08 mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA 80 ng,DNA聚合酶1μL,此為最優(yōu)的反應體系。

杏;自交不親和;S-RNase基因;體系優(yōu)化

Abstract:In this experiment,the leaves of three Xinjiang apricot cultivas were used as test materials,and their DNAs were used as templates,6 levels of 10×buffer,primer,dNTP mixture,DNA polymerase and annealing temperature were set in this experimentation to study the PCR amplification conditions of self-incompatibility S-RNase gene in Xinjiang apricost and establish optimal PCR ampilification system.The results showed that the amplification program was 94℃predegradation for 5 min,94℃degradation for 45 s,52℃anneal for 45 s,72℃extension for 2 min,after 35 cycles 72℃extension for 10 min;the 25μL reaction mixture contained 10×Buffer(include Mg2+)2.5μL,dNTP mixture 0.08 mmol/L,each primer 0.16μmol/L,DNA 80 ng,Taq DNA polymerase 1μL,which is the optimum system.

Key words:apricot;self-incompatibility;S-RNase gene;PCR system;optimization

新疆是世界杏的起源中心之一,具有豐富的杏品種資源[1]。2005年新疆杏的栽培面積達到1.5×105hm2,鮮杏產(chǎn)量70萬t,已經(jīng)成為新疆僅次于葡萄、蘋果的第三大果品。新疆杏加工和鮮食特性優(yōu)良,具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。自治區(qū)“十一五”園藝發(fā)展規(guī)劃,在2010年末新疆杏栽培面積要達到2×105hm2,屆時杏將成為新疆首要的特色果品之一。

新疆杏品種都屬于自交不親和的品種,其自交親和性普遍被認為屬于S-RNase體系的配子體自交不親和體系,受1個具有復等位基因的S-位點控制,S-位點至少包括2個基因,1個在花柱中特異表達,稱花柱 S-RNase基因,另1個在花粉中特異表達,稱花粉SFB基因。當雌雄性器官具有相同的S-等位基因時,交配不親和,花粉管在花柱中生長受到抑制,不能延伸生長進入子房;當雌雄雙方的 S-基因不同時,交配能親和,花粉能順利生長進入子房,完成受精[2]。研究建立優(yōu)化的 S-RNase基因 PCR擴增體系有利于快速、準確的鑒定自交不親和的SRNase基因型,為科學的配置杏授粉品種,提高杏的產(chǎn)量提供有利的技術支撐。

目前,關于利用特異引物PCR方法檢測杏的自交不親和S-RNase基因的報道有:Sutherland等[3]利用PCR技術對“Lambertin”等5個杏品種的S-基因進行了擴增;齊潔等[4]利用特異等位基因PCR方法鑒定了巴旦水杏(Prunus aremeniacaL.cv.Badanshui)、紅玉杏(P.aremeniacaL.cv.Hongyu)及凱特杏(P.aremeniaca L.cv.Katy)3個品種的SRNase基因;馮建榮等[5]利用特異PCR技術成功地在凱特(P.aremeniacaL.cv.Katy)和新世紀杏(P.aremeniacaL.cv.Xinshiji)上鑒定出了3個新的SRNase基因;張立杰等[6]利用PCR方法比較分析了5對薔薇科李屬通用的引物組合對30個中國杏品種S-基因特異PCR的擴增效果。

本研究以新疆杏品種為試材,在前人的研究基礎上進一步調(diào)整和優(yōu)化PCR體系的各組份和擴增程序,旨在建立優(yōu)化的新疆杏品種S-RNase基因的PCR擴增體系,為深入系統(tǒng)的研究新疆杏品種 SRNase基因型的鑒定提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

本實驗材料均采于新疆農(nóng)業(yè)科學院輪臺國家果樹資源圃,品種名分別為:蘇陸克、貝新納爾、辣椒杏,五月底采集剛成熟的嫩葉洗凈晾干后硅膠干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

10×Buffer(含Mg2+)和 Taq DNA聚合酶購自廣東東盛公司 ;dNTP購買自加拿大Bio Basic Inc公司。引物均由上海生工合成。

1.2 方法

利用CTAB法提取杏葉片基因組DNA,50μL TE溶解DNA產(chǎn)物,紫外分光光度計檢測DNA的濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 PCR體系、程序及檢測

本實驗采用馮建榮等[5]報道的P系為參考體系,組分分別為:10×Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 0.2 mmol/L、上下游引物:0.2 μmol/L(上游引物:5′-GGCCAAGTAATTATTCAAACC-3′,下游引物:5′-CATAACAAARTACCACTTCATGTAAC-3′)、 Taq DNA聚合酶 0.25μL、DNA 50～100 ng;擴增程序為:94℃預變性5 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個循環(huán)后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,電壓120 V,電泳時間為25 min,溴化乙錠染色。

1.2.2 實驗設計

對體系中的4個組分和退火溫度均設6個梯度,如表1所示。

在進行PCR擴增體系的優(yōu)化過程當中,只調(diào)整單個試驗因素的梯度水平,其他條件均按1.2.1中進行設置。

表1 體系中4種組分和退火溫度梯度設計Tab.1 The gradient design of 4 compositions and annealing temperature of the system

2 結果與分析

2.1 10×Buffer(含Mg2+)濃度對 PCR結果的影響

結果見圖1。

圖1顯示:梯度1～梯度4對3個新疆杏品種的PCR擴增效果呈明顯的梯度差異,隨濃度的增加擴增效果越來越好,但梯度4～梯度6的擴增效果卻無明顯的變化。從最佳的擴增效果和節(jié)省成本二方面判斷,10×Buffer(含Mg2+)在梯度4時的濃度為最佳選擇,為2.5μL。

圖1 不同10×Buffer(含Mg2+)濃度時3個杏品種PCR擴增結果Fig.1 The amplification of PCR with different grads of 10×Buffer(Mg2+)for 3 apricot cultivars

2.2 dNTP濃度梯度對PCR結果的影響

結果見圖2。

圖2顯示,6種dN TP濃度對3個新疆杏品種的擴增效果沒有明顯的差異,只有梯度1的擴增效果稍差,其它基本相同。由此可見,dN TP在梯度2時的濃度足以滿足25μL PCR擴增體系中的需要,此時dNTP在體系中的濃度為0.08 mmol/L。

圖2 不同dNTP濃度時3個杏品種的PCR擴增結果Fig.2 The amplification of PCR with different grads of dNTP for 3 apricot cultivars

2.3 引物濃度梯度對PCR結果的影響

結果見圖3。

圖3顯示,6種引物濃度對3個新疆杏品種的擴增效果具有一定的梯度差異,從梯度1到梯度4擴增效果越來越好,從梯度4到梯度6擴增效果沒有明顯的變化,說明梯度4時引物的濃度已經(jīng)可以滿足25μL PCR擴增體系的需要,此時上下引物的濃度為0.16μmol/L。

圖3 不同引物濃度時3個杏品種PCR擴增結果Fig.3 The amplification of PCR with different grads of concentrati f pims 3 ulv

2.4 Taq DNA聚合酶濃度梯度對PCR結果的影響

結果見圖4。

圖4顯示,6種 Taq DNA聚合酶濃度對3個新疆杏品種的擴增效果無明顯的梯度差異,只是在梯度1時擴增效果稍差,其它5個梯度對3個品種的擴增效果基本相同,因此,以節(jié)約成本為原則,選擇梯度2時的濃度最好,此時,加入25μL體系中的Taq DNA聚合酶的用量為0.2μL。

圖4 不同Taq DNA聚合酶濃度時3個杏品種PCR擴增結果Fig.4 The amplification of PCR with 6 different grads of concentration of TaqDNA polymarse for 3 apricot cultivars

2.5 退火溫度對PCR結果的影響

結果見圖5。

圖5顯示,不同的退火溫度對新疆杏品種的PCR擴增結果差異較大。當退火溫度較低時,如梯度1和梯度2,3個新疆杏品種的PCR擴增結果中均出現(xiàn)了非特異性條帶;當退火溫度較高時,如梯度4、梯度5和梯度6,3個新疆杏品種的 PCR擴增結果中的條帶較暗甚至消失;而退火溫度在梯度3時,3個新疆杏品種均擴出了清晰的2個條帶。由此可見,梯度3時的退火溫度為擴增新疆杏品種的最優(yōu)退火溫度,此時的退火溫度為52℃。

圖5 6種退火溫度時3個杏品種PCR擴增結果Fig.5 The amplification of PCR with 6 different grads of concentration of Taq DNA polymerase for 3 apricot cultivars

3 討論

目前,特異引物PCR技術已經(jīng)廣泛的應用于杏自交不親和相關S-RNase基因的檢測,并且在部分杏品種上已經(jīng)成功的檢測到了相應的S-RNase基因條帶,與此同時關于擴增杏品種自交不親和SRNase的PCR擴增體系也已經(jīng)有了一定的研究,但這些研究大都針對歐洲品種群和華北品種群。本研究以新疆杏品種(中亞品種群)為研究對象,建立了一種適合新疆地區(qū)杏品種的自交不親和S-RNase基因的擴增體系,為快速、準確的鑒定新疆杏品種的S-RNase基因型,科學配置授粉杏品種提供了有力的技術支撐。

由于在實際的DNA提取中,各個樣品的獲得率不完全相同,DNA濃度不可能完全一致,結果證實本實驗所提取的DNA濃度都能滿足PCR擴增的需要,而且它們之間的差異不會對PCR的結果產(chǎn)生影響。為此,在前人研究的基礎上,本實驗忽略了由于DNA濃度的差異對PCR結果產(chǎn)生的影響,只對 PCR體系中的 10×Buffer(含 Mg2+)、dNTP、上下游引物、DNA Taq酶、退火溫度5個反應因子做了調(diào)整,同時本著最大限度降低成本的原則,從中選出了適合新疆杏品種PCR擴增的各因子的使用量或溫度值。

通過比較,10×Buffer(含 Mg2+)、退火溫度 2個因子與前人的報道沒有變化,而dNTP、上下游引物、DNA Taq酶3個因子在用量上都有所降低,因此,本實驗優(yōu)化后的體系在完成新疆杏品種 SRNase基因擴增的同時,在實驗成本上有所降低,為今后新疆杏品種S-RNase基因的研究提供了更為經(jīng)濟、有效的技術支撐。

4 結論

本實驗所得出的擴增新疆杏品種S-RNase基因PCR優(yōu)化反應體系程序為:94℃預變性5 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個循環(huán)后72℃延伸10 min;25μL反應體系成份為:10×Buffer(含 Mg2+)2.5μL,dNTP 0.08 mmol/L,上下引物0.16μmol/L,Taq酶1μL。

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Optimization of Self-Incompatibility S-RNase Gene PCR Ampilification System in Xinjiang Apricots

J IANG Xin1,FENGJianrong1,J IANGJunqing1,WANG Dajiang1,LIU Yuexia1
(College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S611.2

A

1007-7383(2010)04-0418-04

2010-01-19

國家自然科學基金項目(30370992),國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2008AA10Z109),國家科技支撐計劃項目(2007BAD36B06)

姜新(1983-),男,碩士生,專業(yè)方向為杏樹種質(zhì)資源與遺傳育種;e-mail:jiangxin831105@163.com。

馮建榮(1969-),女,教授,從事果樹種質(zhì)資源與分子輔助育種研究;e-mail:fengjr102@126.com。