翟麗芬,鄧 琴

(1.嘉祥縣環(huán)保局,山東嘉祥272400;2.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海201620)

金魚組織中壬基酚的含量檢測新方法探討

翟麗芬1,鄧 琴2

(1.嘉祥縣環(huán)保局,山東嘉祥272400;2.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海201620)

建立一種直接檢測環(huán)境中痕量壬基酚的外切酶保護-熒光定量PCR方法。首先向含雌激素受體及相關(guān)蛋白的細胞溶質(zhì)中加入壬基酚-丙酮溶液,使受體蛋白活化,從而在體外與含雌激素反應(yīng)位點的雙鏈結(jié)合DNA作用形成壬基酚-雌激素受體-DNA復(fù)合物。復(fù)合物用核酸外切酶和S1核酸酶消解,去除未受到蛋白質(zhì)保護的結(jié)合DNA。將消解后產(chǎn)物作為模板,進行熒光定量PCR擴增反應(yīng),建立壬基酚濃度與標準DNA拷貝數(shù)的對數(shù)之間的線性關(guān)系為:y(壬基酚濃度的對數(shù))=11637x(標準DNA拷貝數(shù)的對數(shù))-91505。該法檢出限為10-8g/L,用該法對金魚肝臟組織中壬基酚進行檢測,添加回收率水平在9815%～11212%,變異系數(shù)在413%以下。

熒光定量PCR;壬基酚;核酸外切酶Ⅲ;檢測

壬基酚(Nonylphenol,NP),分子式C15H24O,是一種人工合成的工農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用的化合物[1]。壬基酚在工業(yè)中主要用于一種性能優(yōu)異的表面活性劑—壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)的合成。NPEOs本身毒性較小,沒有明顯的雌激素效應(yīng),但這類化合物在環(huán)境中不穩(wěn)定,在污水處理廠的處理過程中,能夠被降解生成NP。降解產(chǎn)物NP及其低分子聚合物的穩(wěn)定性增加,水溶性降低,脂溶性增強,毒性也明顯增加。NP的親脂性較強,其辛醇-水分配系數(shù)為logkow=412～415[2],因此易于吸附在有機物和顆粒物表面上。在污水處理廠中大部分NP進入污水處理池的沉降泥渣中,殘留的NP隨出水排放到周圍環(huán)境中,并成為納污水域魚類和其它水生生物的暴露源[3]。

目前NP對野生動物影響的研究大多集中于魚類,因為魚類對EDCs的作用比較敏感[4]。Ni mrod等發(fā)現(xiàn)鯰魚體內(nèi)雌激素受體水平的上升與NP暴露相關(guān)[5]。Purdom等人在英國一些污水處理廠出水口下游的河流中發(fā)現(xiàn)斜齒鳊魚的雄性個體出現(xiàn)了雌性化特征,其活性物質(zhì)最終被確定為壬基酚(NP)[6]。周忠良等研究NP對鯽魚的雌激素效應(yīng)發(fā)現(xiàn),腹腔注射0101mg/kg的17β-雌二醇(E2)處理組和1100mg/kgNP處理組,鯽魚血漿中卵黃蛋白原含量沒有顯著差異[7]。壬基酚的檢測方法主要是色譜法[8]。但是用色譜法不僅昂貴費時,而且分析過程繁瑣冗長。近年來,隨著生物技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了許多壬基酚的生物檢測方法,如:免疫生物技術(shù)、芯片技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)及慧星試驗等。生物檢測技術(shù)靈敏、快速、經(jīng)濟,特別適用于基層大量樣本的篩選。生物檢測中,PCR檢測技術(shù)由于其靈敏度高,簡單易行,受到了廣泛關(guān)注。但PCR技術(shù)目前主要應(yīng)用于檢測壬基酚的雌激素效應(yīng)[9,10],直接檢測環(huán)境樣本中壬基酚的含量的研究報導(dǎo)較少。

NP作為雌激素受體(Estrogen receptor,ER)的配體,能夠與雌激素受體結(jié)合并能誘導(dǎo)雌激素受體介導(dǎo)的基因表達,其作用過程為:NP與細胞膜或細胞質(zhì)中的雌激素受體結(jié)合,然后這種結(jié)合體遷移到細胞核并與核內(nèi)DNA上的雌激素反應(yīng)位點(estrogen responsive elements,EREs)結(jié)合,上行調(diào)節(jié)雌激素響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)進入相應(yīng)的靶組織或靶器官從而引起雌激素效應(yīng)。根據(jù)此原理,本研究建立一種直接檢測環(huán)境中痕量壬基酚的外切酶保護-熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

主要試劑包括壬基酚(日本東京化成工業(yè)株式會社),核酸外切酶Ⅲ(fer mentas公司),S1 nucle2 ase(fer mentas公司),PCR試劑盒(博大泰克公司),PCR純化試劑盒(博大泰克公司),SY BR Green I PCR mix(上海閃晶生物科技有限公司),試驗所用其它試劑均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 分析儀器

主要試驗用儀器包括UV-2000紫外分光光度計;梯度PCR儀;rotor-gene 3000熒光定量PCR儀;DYY-11型電泳儀(北京市六一儀器廠);Tanon-2500R數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;pH SJ-4A實驗室pH計(上海精科)。

1.3 動物

實驗用金魚購自上海松江菜花涇農(nóng)貿(mào)市場,全長615±015cm(平均值 ±標準差),體重718±115g。在去氯自來水中馴養(yǎng)7d后,投壬基酚-丙酮溶液使魚缸中水的壬基酚暴露濃度為0101mg/L。實驗過程中采用靜態(tài)換液,每24h更換1次。喂養(yǎng)30d。

1.4 試驗方法

1.411 含EREs的雙鏈DNA的制備

將pUC19質(zhì)粒稀釋50倍作為模板,用設(shè)計合成的含有雌激素反應(yīng)位點的上下游引物[11],通過常規(guī)PCR方法擴增,制得雙鏈DNA。引物序列分別如下:上游引物:5′CGGAG TTCCG TGAGA AGAGG ATAAC GCAGG AAAGA ACATG 3′;下游引物:5′CTCTT CTCAC GCAAC TCCGG TCAGG CAACT ATGGA TGAAC 3′。PCR產(chǎn)物是一條924 bp雙鏈DNA,5′和3′端各含一個EREs。于1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離,PCR產(chǎn)物快速純化試劑盒純化回收。用紫外分光光度法測回收DNA的濃度并檢測回收效果。將DNA濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù),然后用滅菌雙蒸水對回收DNA進行10倍稀釋,用于定量標準曲線的建立。

1.412 標準曲線的建立

以上述稀釋后不同拷貝數(shù)的結(jié)合DNA作為模板,各取215μl,加入SYBR Green I Master mix 10μl(MgCl2最佳濃度為2μmol/L),上下游引物(10μmol/L)各1μl,滅菌雙蒸水515μl。熒光定量PCR循環(huán)步驟:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,循環(huán)40次。最后在72℃延伸5min。

1.413 活化雌激素受體

取暴露馴養(yǎng)的金魚,用5mg/L的苯佐卡因麻醉。取出魚肝臟,用0115mol/L冰上預(yù)冷的氯化鉀溶液洗去肝臟外血液,稱重,按m(肝臟)∶v(緩沖液)=1∶4的比例加入HEDG緩沖液(冰上預(yù)冷)于玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于12000g離心20min,收集上清。再于16000g離心1h,小心吸取上清,即為含有雌激素受體的細胞溶質(zhì)[12]。用Bradford法測定蛋白濃度[13]。將1g/L的壬基酚按10倍比稀釋為011g/L～1ng/L,各取10μl,加入上述提取的細胞溶質(zhì)250μl,于20℃振蕩溫育2h。

1.414 壬基酚、雌激素受體、DNA的結(jié)合反應(yīng)與酶切保護處理

從上述不同濃度壬基酚與含雌激素受體的細胞溶質(zhì)結(jié)合形成的受體-配體復(fù)合物中,每管取出20μl于115ml EP管中,加入1μg的poly(di1dc)于20℃溫育15min后,再加入2μl未經(jīng)稀釋的回收DNA,繼續(xù)20℃溫育15min,此時溶液中為壬基酚、雌激素受體、結(jié)合DNA的復(fù)合物,即受體-配體-結(jié)合DNA復(fù)合物。

酶切步驟:從上述受體-配體-DNA復(fù)合物中各取12μl于滅菌后115ml EP管中,按6∶1∶1的比例加入ExoⅢbuffer、HEDG緩沖液,使總體積為20μl,混勻后37℃溫育15min。再每管加入ExoⅢ100U,混勻后于37℃溫育15min。按照1∶3的比例,加入S1(2U/μl)混合液,37℃溫育30min。再各加入4μl S1停止液(013mol/L Tris堿,1135mol/L EDTA),70℃滅活10min。得到熒光定量PCR的模板。

1.415 不同濃度壬基酚誘導(dǎo)結(jié)合DNA的定量PCR測定

以受體-配體-結(jié)合DNA復(fù)合物酶切產(chǎn)物作為模板,按照標準曲線建立方法進行PCR擴增,繪制壬基酚濃度相對應(yīng)雙鏈結(jié)合DNA拷貝數(shù)的曲線圖。結(jié)合標準曲線,建立壬基酚濃度-Ct值關(guān)系曲線,從而建立檢測壬基酚FQ-PCR方法。參考文獻,提取金魚魚肉組織,用FQ-PCR檢測金魚體內(nèi)壬基酚殘留含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量標準曲線的建立

SYBR Green I熒光定量PCR是近年來出現(xiàn)的具有高靈敏度的定量PCR方法,它是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入了SYBR Green I染料,此染料可與雙鏈DNA結(jié)合,發(fā)出熒光信號,且熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。當熒光信號達到一定閾值時,循環(huán)次數(shù)(Ct值)被記錄下來,Ct值和初始模板量的對數(shù)值有嚴格的線性關(guān)系,從而達到定量的目的。

通過常規(guī)PCR擴增制備含EREs的雙鏈DNA,純化回收后,用紫外分光光度法測得OD260/OD280比值為1176,說明回收DNA純度高,無污染。OD260值為01208,計算得DNA濃度為10μg/ml。一個質(zhì)粒質(zhì)量MW=924bp323330=609840g,一個質(zhì)粒(拷貝數(shù))的質(zhì)量:609840/6103310-23=110125310-9ng=1310-9ng,從而回收DNA為1010copies/μl。然后用滅菌雙蒸水進行10倍稀釋,梯度為108～103copies/μl,進行熒光定量PCR擴增,擴增曲線如圖1所示。為了確定熒光定量PCR體系的重復(fù)性,每個濃度各設(shè)立兩個對照組。用Ct值與其對應(yīng)的不同定量模板的對數(shù)擬合作圖,其中橫坐標代表不同定量模板起始拷貝數(shù),縱坐標代表Ct值,得出一條定量標準曲線,如圖2所示,在103～108copies/μl范圍內(nèi),Ct值與起始模板濃度的對數(shù)之間有很好的線性關(guān)系。兩者關(guān)系式為y(Ct)=-31008x(模板初始拷貝值的對數(shù))+281855,相關(guān)系數(shù)R2=0199120。模板拷貝數(shù)每增加10倍,Ct減小3～4,變化幅度足以區(qū)分兩個不同濃度的模板。PCR擴增效率為1115。

2.2 蛋白質(zhì)濃度測定的標準曲線

蛋白質(zhì)濃度測定的標準曲線見圖3,將在波長為595 nm處測定的吸光度代入解析式即可得到相應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

將提取的魚肝細胞質(zhì)溶液稀釋10倍后取1ml與5ml考馬斯亮藍試劑混合,各管搖勻后放置2 min,用分光光度計測定595 nm處的吸光值,測得吸光度值分別為01500。代入標準曲線方程計算得到蛋白質(zhì)溶液濃度,根據(jù)稀釋倍數(shù)換算,壬基酚暴露后,提取的金魚肝臟細胞溶質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度為85813μg/ml。按20(蛋白質(zhì)質(zhì)量)∶1(壬基酚溶液體積)的比例進行受體-配體復(fù)合。

2.3 壬基酚劑量-效應(yīng)曲線

以不同濃度壬基酚誘導(dǎo)的受體-配體-結(jié)合DNA復(fù)合物作為模板,按照標準曲線建立方法進行PCR擴增,擴增結(jié)果如表1所示。Ct值隨著復(fù)合物中加入壬基酚濃度的增加而減少,在10-8～10-2g/L濃度范圍內(nèi),壬基酚濃度每增加10倍,Ct減小3～4。丙酮處理組與PCR陰性對照組都沒有檢測到熒光信號。結(jié)果表明熒光定量PCR可以用于檢測不同濃度壬基酚誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)合DNA量。將高于設(shè)定的基線閾值3倍的標準差的熒光信號設(shè)為陽性,即陽性信號≥基線閾值+33SD,根據(jù)這個標準確定該方法對壬基酚最低檢測線為10-8g/L。

表1 不同濃度壬基酚誘導(dǎo)結(jié)合DNA的PCR擴增結(jié)果

結(jié)合標準曲線方程,得到壬基酚濃度與標準DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系,如圖4。

經(jīng)回歸分析,得到壬基酚濃度與標準DNA拷貝數(shù)的對數(shù)之間的線性關(guān)系。兩者線性關(guān)系式為:y(壬基酚濃度的對數(shù))=11637x(標準DNA拷貝數(shù)的對數(shù))-91505。通過求熒光定量PCR所測的結(jié)合DNA的量,就可以求知壬基酚的量。

2.4 精密度、準確度試驗及回收率計算

取一條金魚的肝腎等組織,濾紙吸干水分后稱重,加入2ml甲醇研磨,研磨后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用1ml甲醇沖洗研磨缽,沖洗后液體也轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。加入5ml正己烷∶乙醚(7∶3)萃取液萃取3次后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干,最后加入丙酮定容為2ml,按上述受體-配體-DNA復(fù)合步驟進行試驗,用建立的外切酶保護-PCR測得預(yù)處理后NP濃度為10μg/L,對應(yīng)魚肝臟中壬基酚的含量為24μg/kg。加入壬基酚標準溶液,添加濃度分別為1μg/L、2μg/L、5μg/L,計算相對偏差和回收率,結(jié)果見表2。回收率范圍在9815%～11212%,RSD在216%～413%,均滿足分析要求。

表2 金魚肝臟中壬基酚的檢測及加標回收

3 結(jié)論

(1)利用熒光定量PCR技術(shù)直接檢測環(huán)境樣本中壬基酚的含量,未見文獻報道。

(2)建立了一種新的直接檢測壬基酚的酶切保護-熒光定量PCR檢測方法。含雌激素反應(yīng)位點的雙鏈DNA與被壬基酚活化的雌激素受體結(jié)合,作為熒光定量PCR的模板。在PCR的基礎(chǔ)上引入外切酶保護,與雌激素受體結(jié)合的DNA受到蛋白質(zhì)的保護,不被核酸外切酶降解,而未受到保護的雙鏈DNA被降解為單鏈。在基礎(chǔ)上利用S1酶完全切除核酸外切酶Exo III酶切后留下的單鏈,使游離DNA完全不能被PCR擴增出,大大降低了假陽性率,提高了靈敏度。

(3)該方法建立了壬基酚濃度與標準DNA拷貝數(shù)的對數(shù)之間的線性關(guān)系為:y(壬基酚濃度的對數(shù))=11637x(標準DNA拷貝數(shù)的對數(shù))-91505。檢出限為10-8g/L,加標回收率范圍在9815%～11212%,RSD在216%～413%,均滿足分析要求。

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Research on a New FQ-PCR Assay for Detection of Nonylphenol in Goldfish

ZHA ILi2fen1,DENGQin2
(1.Jiaxiang Environmental Protection Bureau of Shandong Province,Jiaxiang Shandong 272400 China)

This study aims to establish an Exonuclease Protection2fluorescence quantitative PCR assay for directly detection of the trace nonylphenol in environment.Estrogen receptor can be activated by nonylphenol so as to com2 bine with a double2stranded DNA which contains estrogen responsive elements.By combined with estrogen recep2 tor,this double2stranded DNA was protected by protein so that it can retain after the digestion of the exonucleaseⅢ.This trace retained DNA could be amplified by FQ2PCR.According to this theory,this research will first add nonylphenol2acetone to solute which contains estrogen receptor and associated protein,and combined to double2 strand DNA with estrogen responsive elements in vitro to format the nonylphenol2estrogen receptor2DNA complex.Then these complexeswere digested by the exonuclease and S1 nuclease to remove the DNA which is not protected by protein.After the digestion,the complexes can be used as a template for FQ2PCR amplification.The relation2 ship bet ween the logarithm of the concentration nonylphenol and the standard DNA copy number was established,linear equation is:y=116455x-91523.This assaywas applied to detect nonylphenol in goldfish,the average re2 coveries prove to be between 78%-93%and the coefficient variation under 413%.

PCR;nonylphenol;exonucleaseⅢ;detection

X83

A

1673-9655(2010)05-0001-05

2009-06-21

上海市基礎(chǔ)研究重點項目(09JC1400600)。