賈彥杰,梁新紅,朱文學(xué),孫俊良,*,郭祖鋒
(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)
不同沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶的研究
賈彥杰1,梁新紅2,朱文學(xué)1,孫俊良2,*,郭祖鋒2
(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)
研究鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法分離甘薯β-淀粉酶的工藝條件,分析鹽析飽和度、有機(jī)溶劑體積比和溶液pH值對(duì)回收率及提純倍數(shù)的影響。結(jié)果表明:硫酸銨飽和度在70%時(shí),酶活性回收率達(dá)到78.1%,提純1.56倍;乙醇體積比4:1時(shí),酶活性回收率達(dá)到76.8%,提純2.61倍;當(dāng)溶液pH4.5~5.0、丙酮體積比3:1時(shí),酶活性回收率可達(dá)到90.66%,提純了3.29倍,此條件下β-淀粉酶分離效果最佳。
甘薯;β-淀粉酶;沉淀;分離;鹽析
Abstract:Salting out and organic solvent precipitation methods were solely used to precipitateβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate. The effects of saturation degree for salting out, volume ratio for organic solvents and pH on the recovery rate and purity ofβ-amylase were investigated. Results indicated that the specific activity ofβ-amylase reached up to 78.1% and its purity exhibited a 1.56-fold enhancement when the saturation degree of ammonium sulfate was 70%; the specific activity ofβ-amylase reached up to 76.8% and its purity exhibited a 2.61-fold enhancement when 4-fold volume of ethanol was added to the supernatant of sweet potato homogenate; and the highest separation efficiency was achieved and the specific activity ofβ-amylase reached up to 90.66% with a 3.29-fold enhancement in purity when pH varied from 4.5 to 5.0 and 3-fold volume of acetone was used instead of 4-fold volume of ethanol.
Key words:sweet potato;β-amylase;precipitation;separation;salting out
β-淀粉酶是一種水解酶,作用于淀粉時(shí),分解淀粉分子中的α-1,4葡萄糖苷鍵,從還原性末端開(kāi)始,按照麥芽糖單位依次水解,同時(shí)發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)化,使產(chǎn)物由α型變?yōu)棣滦望溠刻牵虼朔Q為β-淀粉酶[1-2]。β-淀粉酶在食品加工、釀造、糧食加工以及醫(yī)藥等行業(yè)具有重要應(yīng)用價(jià)值[3]。β-淀粉酶存在于植物與微生物中,而我國(guó)目前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的β-淀粉酶主要有耐熱性差,成本較高等缺點(diǎn)。而從植物中提取的β-淀粉酶具有酶活力高、耐熱性較好、作用pH值范圍廣等特點(diǎn)。植物β-淀粉酶主要存在于甘薯、麥麩、大豆、大麥芽以及蘿卜中。我國(guó)甘薯、麥麩產(chǎn)量很高,價(jià)格低廉,可以從中提取β-淀粉酶[4]。甘薯β-淀粉酶酶活力高、淀粉易回收,因此甘薯是制備β-淀粉酶最為理想的原料[5]。
鹽析沉淀法是許多酶初純階段經(jīng)常采用的方法,而有機(jī)溶劑沉淀無(wú)需專門方法去除沉淀劑,此法簡(jiǎn)便、安全[6]。目前,關(guān)于乙醇沉淀分離β-淀粉酶的研究已有報(bào)道[7],而有關(guān)鹽析及其他有機(jī)溶劑沉淀分離β-淀粉酶相比較的工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)硫酸銨鹽析、乙醇及丙酮沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶,以期找到較為合適的分離方法,為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
甘薯 市售;考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水楊酸等(均為分析純)。
RC5C型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sovall公司;pHSJ-3F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)、FA1204B型分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;7200型分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司;SQ2002多功能食品加工機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司;MD34透析袋(8000~14000kD) 美國(guó)聯(lián)合碳化物公司。
取新鮮甘薯50g,洗凈后切成1cm3左右小塊,加入100mL的去離子水,于勻漿機(jī)中勻漿(26000r/min,1min),4層紗布過(guò)濾,濾液冷凍離心(4℃,4000r/min,15min),取上清液4℃冰箱中保藏備用。
取7支試管,每支加入粗酶液5mL,分別加入硫酸銨至飽和度為20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%,邊加邊攪拌,混勻后,用磷酸-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0,4℃冰箱中放置4h,8000r/min冷凍離心15min后,收集沉淀。將沉淀用磷酸緩沖液溶解,選用截留分子量為1萬(wàn)D的透析袋透析除鹽24h。測(cè)透析后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量,計(jì)算出回收率及提純倍數(shù)。
取一定量粗酶提取液,緩慢加入預(yù)冷乙醇或丙酮分別至不同體積比(乙醇:粗酶液,V/V,下同),用磷酸-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0,4℃冰箱中放置4h,8000r/min冷凍離心15min后,收集沉淀,將沉淀用磷酸緩沖液溶解。測(cè)沉淀分離后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量,計(jì)算出回收率及提純倍數(shù)。
蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]。
植物β-淀粉酶提取過(guò)程中有許多成分的物質(zhì)溶出,除雜與提純是確定酶活性穩(wěn)定的要素[10]。選用不同飽和度硫酸銨鹽析甘薯粗提取液,根據(jù)1.3.2節(jié)所述方法,考察不同飽和度硫酸銨對(duì)甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)影響,結(jié)果見(jiàn)圖1、2。
圖1 不同飽和度硫酸銨對(duì)β-淀粉酶回收率的影響Fig. 1 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate
圖2 不同飽和度硫酸銨對(duì)β-淀粉酶提純倍數(shù)影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate
圖1表明,不同飽和度硫酸銨對(duì)β-淀粉酶回收率影響較大。硫酸銨飽和度在20%~40%范圍內(nèi),回收率變化不大。隨著硫酸銨飽和度增加,酶活回收率呈增大趨勢(shì),在70%時(shí)β-淀粉酶活性回收率最高達(dá)到(78.05±0.8)%,飽和度在大于80%時(shí),酶活回收率迅速降低。分析圖2可知,硫酸銨飽和度在70%時(shí),提純倍數(shù)達(dá)到最大,提純(1.56±0.031)倍。經(jīng)顯著性方差分析,硫酸銨飽和度在60%~80%范圍內(nèi),P<0.05水平上回收率及提純倍數(shù)都有顯著性差異,因此,硫酸銨鹽析β-淀粉酶最佳飽和度為70%。
圖3 不同體積比乙醇對(duì)甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.3 Effect of ethanol amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate
由圖3可知,在乙醇體積比為0.2:1~4:1條件下,酶活性回收率隨著乙醇體積比的增加而增大,在4:1處達(dá)到最大為(76.80±0.03)%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的乙醇體積比不同,可能是因?yàn)楦适聿煌贩N所致[11]。經(jīng)顯著性方差分析,乙醇體積比在3:1~4:1范圍內(nèi),在P<0.05水平上沒(méi)有顯著性差異。圖4結(jié)果表明,在體積比0.2:1~5:1范圍內(nèi),提純了(0.21±0.014)~(2.62±0.16)倍,在體積比4:1時(shí),提純倍數(shù)達(dá)到最大,達(dá)到2.62倍。經(jīng)顯著性方差分析,在體積比3:1~5:1范圍內(nèi),在P<0.05水平上有顯著性差異。因此,乙醇沉淀β-淀粉酶最佳體積比為4:1。
圖4 不同體積比乙醇對(duì)甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.4 Effect of ethanol amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate
圖5 不同體積比丙酮對(duì)甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.5 Effect of acetone amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate
圖6 不同體積比丙酮對(duì)甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.6 Effect of acetone amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate
由圖5可知,不同的丙酮與粗酶液體積比對(duì)β-淀粉酶回收率影響較大。體積比為0.2:1~3:1范圍時(shí),酶活回收率逐漸升高,在3:1處達(dá)到最大,回收率為(88.05±0.05)%,然后隨著丙酮用量的增加,回收率逐漸降低。圖6分析可知,丙酮與粗酶液體積比為3:1時(shí),提純倍數(shù)最高,提純(2.64±0.09)倍。經(jīng)顯著性方差分析,在丙酮體積比2:1~4:1范圍內(nèi),P<0.05水平上回收率及提純倍數(shù)都有顯著性差異。因此,丙酮沉淀β-淀粉酶最佳體積比為3:1。
由以上硫酸銨、乙醇、丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶對(duì)比實(shí)驗(yàn)可知,丙酮沉淀效果最佳,在丙酮與粗酶液體積比3:1時(shí),回收率及提純倍數(shù)達(dá)到最高,分別為(88.05±0.05)%、2.64±0.09。
由于酶蛋白在其等電點(diǎn)處?kù)o電荷為零,溶解度最低,容易沉淀析出,故在確定丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶體積比3:1為最佳分離條件后,按上述工藝加入丙酮,用磷酸緩沖液分別調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,測(cè)定甘薯β-淀粉酶酶活及蛋白含量。計(jì)算酶活回收率及提純倍數(shù),結(jié)果如圖7、8所示。
圖7 不同pH值對(duì)甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.7 Effect of pH of acetone solution on the recovery rate ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate
圖8 不同pH值對(duì)甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.8 Effect of pH of acetone solution on the purification fold ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate
由圖7分析可知,沉淀β-淀粉酶時(shí)pH值對(duì)酶回收率影響較明顯。在pH4.0~4.5范圍內(nèi),酶活性回收率迅速增大,在pH4.5時(shí)達(dá)到最大值(90.66±0.02)%,隨著pH值繼續(xù)增大,回收率又逐漸降低。圖8表明,pH值對(duì)β-淀粉酶提純倍數(shù)影響較大,變化范圍為(2.27±0.12)~(3.29±0.17),在pH5.0處達(dá)到最大,提純(3.29±0.17)倍。經(jīng)顯著性方差分析,在pH4.5~5.5范圍內(nèi),P<0.05水平上酶活回收率沒(méi)有顯著性差異,在pH4.0~6.0范圍內(nèi)提純倍數(shù)有顯著性差異。綜合分析,pH5.0為丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值。
3.1 通過(guò)對(duì)硫酸銨鹽析和有機(jī)溶劑沉淀甘薯β-淀粉酶進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn),得出利用丙酮沉淀分離β-淀粉酶為最佳的分離條件,當(dāng)丙酮體積比3:1、pH4.5~5.0時(shí)回收率最高可達(dá)90.66%,提純3.29倍,這與李瑩等[7]的乙醇沉淀甘薯β-淀粉酶結(jié)果相比較,提純倍數(shù)有較大的提高,由此可知,用丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶更為合理。
3.2 隨著pH值的變化,酶活性回收率及提純倍數(shù)變化幅度較大,說(shuō)明在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下,酶液易失活[12-13]。在pH4.5處,酶液表現(xiàn)出較高活性。
3.3 通過(guò)最佳pH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在pH5.0處提純倍數(shù)達(dá)到最高,由于在等電點(diǎn)處蛋白質(zhì)易沉淀,可知甘薯β-淀粉酶的等電點(diǎn)應(yīng)為5.0左右。這與朱婉華等[14]測(cè)得的大豆β-淀粉酶等電點(diǎn)基本一致。
3.4 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)β-淀粉酶分離方法的比較實(shí)驗(yàn),得出了較為合適的分離方法,為β-淀粉酶的進(jìn)一步純化提供了重要依據(jù)。
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Separation ofβ-amylase from Sweet Potato by Different Precipitation Methods
JIA Yan-jie1,LIANG Xin-hong2,ZHU Wen-xue1,SUN Jun-liang2,*,GUO Zu-feng2
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;2. College of Food, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)
Q814.1
A
1002-6630(2010)18-0022-04
2010-05-20
河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(102102210192);河南科技學(xué)院博士基金項(xiàng)目(09001)
賈彥杰(1985—),男,碩士研究生,主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail:henankeyuan@126.com
*通信作者:孫俊良(1964—),男,教授,博士,主要從事食品發(fā)酵微生物與酶制劑研究。E-mail:sjl@hist.edu.cn