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        利用熒光假單胞菌固定化細(xì)胞生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸

        2010-10-19 05:25:52苗曉燕張?bào)忝?/span>孫文敬
        食品科學(xué) 2010年21期
        關(guān)鍵詞:質(zhì)量

        陳 萍,苗曉燕,張?bào)忝?,?強(qiáng),孫文敬,3,*

        (1.保定學(xué)院生化系,河北 保定 071000;2.百勤異VC鈉有限公司,江西 德興 334221;3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

        利用熒光假單胞菌固定化細(xì)胞生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸

        陳 萍1,苗曉燕1,張?bào)忝?,周 強(qiáng)2,孫文敬2,3,*

        (1.保定學(xué)院生化系,河北 保定 071000;2.百勤異VC鈉有限公司,江西 德興 334221;3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

        以海藻酸鈉為載體固定熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4,考察固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的條件。結(jié)果表明:利用5.0%海藻酸鈉制備的固定化細(xì)胞顆粒穩(wěn)定性好,可重復(fù)利用7次;發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿的最適質(zhì)量濃度為0.75g/100mL,固定化細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度為30~36℃;在適宜的培養(yǎng)條件下,固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率基本相同,分別可達(dá)13.5g/100mL和90.0%左右。

        固定化細(xì)胞;熒光假單胞菌;2-酮基-D-葡萄糖酸;海藻酸鈉;發(fā)酵

        Abstract:The cells ofPseudomonas fluorescensAR4 were immobilized by sodium alginate, and the optimization of fermentation conditions for producing 2-keto-D-gluconic acid by immobilized cells were investigated. The results showed that 5.0% of sodium alginate was the optimal carrier for immobilizingPseudomonas fluorescensAR4 to give a high yield, and the immobilized cells could be reused for 7 times. The optimal concentration of corn steep liquor in fermentation medium was 0.75 g/100 mL, and fermentation temperature was between 30 ℃ and 36 ℃. Under the optimal conditions, immobilized cells and free cells could give similar yield and conversion rate of 13.5 g/100 mL and 90.0%, respectively.

        Key words:immobilized cell;Pseudomonas fluorescens;2-keto-D-gluconic acid;sodium alginate;fermentation

        固定化細(xì)胞技術(shù)是保持生物催化劑穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其使用壽命、增加生產(chǎn)能力的重要手段[1]。固定化細(xì)胞的制備方法主要有吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法及包埋法等4類(lèi)[2]。其中,包埋法是研究與生產(chǎn)中最常用的細(xì)胞固定化方法,具有方法簡(jiǎn)單、條件溫和、穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度較高等優(yōu)點(diǎn)[3]。海藻酸鈉是包埋法常用的載體之一,固化成形方便,對(duì)微生物毒性小,以其制備的固定化細(xì)胞密度高[4],因此在細(xì)胞固定化中得到了廣泛使用。目前有關(guān)固定化細(xì)胞在發(fā)酵工程中的應(yīng)用研究較多[5-10],但關(guān)于利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)的研究報(bào)道較少。

        2KGA是生產(chǎn)食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及D-異抗壞血酸鈉的前體,工業(yè)上通常采用細(xì)菌發(fā)酵的方法由D-葡萄糖轉(zhuǎn)化而來(lái)[11-12]。我國(guó)是目前國(guó)際上最大的2KGA生產(chǎn)國(guó),生產(chǎn)規(guī)模達(dá)到了50000t/年,但在發(fā)酵生產(chǎn)中仍存在著能源消耗大、產(chǎn)物提取率不高、發(fā)酵菌體沒(méi)有得到充分利用等問(wèn)題[13]。本研究探索利用固定化細(xì)胞進(jìn)行2KGA的發(fā)酵生產(chǎn),以達(dá)到盡可能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵菌體的循環(huán)利用、有效提高發(fā)酵產(chǎn)物純度的目的。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4是以熒光假單胞菌A46為親株誘變選育的抗噬菌體菌株[14]。

        海藻酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。培養(yǎng)基(g/L):斜面培養(yǎng)基:牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、瓊脂20.0、pH7.0;種子培養(yǎng)基:葡萄糖20.0、玉米漿10.0、尿素 2.0、KH2PO42.0、MgSO4·7H2O 0.5、pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖140.0、玉米漿10.0、CaCO345.0、pH6.7。

        752型分光光度計(jì) 天津拓普儀器有限公司;SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;WZZ-1SS數(shù)字式自動(dòng)旋光儀 上海精密儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 固定化細(xì)胞的制備

        游離細(xì)胞的培養(yǎng)及菌懸液的制備:將活化的斜面菌種分別接種于若干裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)20h。取100mL種子培養(yǎng)液4000r/min離心20min,收集濕菌體。用生理鹽水洗滌濕菌體兩次,再用生理鹽水將其制成0.25g/mL的菌懸液(約5×108cells/mL)。

        固定化細(xì)胞的制備:按1:1的比例,將菌懸液分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的海藻酸鈉溶液混合均勻。然后用無(wú)菌注射器將混合液緩慢滴入0.05 mol/L的CaCl2溶液中,形成直徑約2.5mm的固定化細(xì)胞顆粒。待固定化細(xì)胞顆粒穩(wěn)定成型后,用生理鹽水洗滌兩次備用。

        1.2.2 固定化細(xì)胞的增殖培養(yǎng)

        將一定量的固定化細(xì)胞(用2mL的菌懸液制備)加入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,30℃增殖培養(yǎng)20h。增殖結(jié)束后,用蒸餾水充分洗滌固定化細(xì)胞。

        1.2.3 固定化細(xì)胞的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

        將上述增殖的固定化細(xì)胞加入裝有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)72h。

        1.2.4 固定化細(xì)胞的重復(fù)利用

        發(fā)酵結(jié)束后,從發(fā)酵液中過(guò)濾分離固定化細(xì)胞,并用蒸餾水充分洗滌其表面殘留物,然后將其重新加入裝有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)72h。

        1.2.5 游離細(xì)胞的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

        將2mL的菌懸液接入裝有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,30℃旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速230r/min、偏心距25mm)振蕩培養(yǎng)72h。

        1.2.6 測(cè)定方法

        1.2.6.1 發(fā)酵液中游離細(xì)胞生長(zhǎng)量(OD690nm值)的測(cè)定

        用0.2mol/L的HCl稀釋發(fā)酵液20倍,以水作空白,用752型分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)690nm處的光密度,比色杯的光程為1cm。

        1.2.6.2 發(fā)酵液中2KGA的測(cè)定

        采用旋光法測(cè)定[14]。取一定量的2KGA發(fā)酵液,4000r/min離心20min以除去沉淀物。然后,取25mL的離心上清液與20mL的蒸餾水混合,攪動(dòng)下用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至1.5~1.6,再在60℃水浴中保溫30min。用冷水將其冷卻至25℃并用蒸餾水定容到100mL,再于4000r/min離心30min,所得上清液作為樣品溶液。25℃條件下,測(cè)定樣品溶液的旋光度及其葡萄糖質(zhì)量濃度,根據(jù)下式計(jì)算發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度。

        式中:Y為發(fā)酵液的旋光度/(°);X1為發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度/(g/100mL);X2為發(fā)酵液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(g/100mL);-0.88為1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°);0.5275為1g/100mL葡萄糖溶液的旋光度 /(°)。

        1.2.6.3 發(fā)酵液中葡萄糖的測(cè)定

        取一定量的2KGA發(fā)酵液,4000r/min離心20min以除去沉淀物。然后,取離心上清液用蒸餾水進(jìn)行適度稀釋?zhuān)?5℃條件下采用生物傳感分析儀測(cè)定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞固定化效果的影響

        表1表明,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,固定化細(xì)胞顆粒的強(qiáng)度明顯增加,可重復(fù)利用次數(shù)增多,有利于固定化細(xì)胞制備成本的降低;但固定化細(xì)胞強(qiáng)度過(guò)大,其彈性勢(shì)必有所下降,有礙底物和產(chǎn)物擴(kuò)散,不利于菌體的生長(zhǎng)和代謝。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小,發(fā)酵液的OD690nm值增大,表明發(fā)酵過(guò)程中固定化細(xì)胞的菌體泄露增多,其可重復(fù)利用的次數(shù)減少。綜合考慮,選用5.0%的海藻酸鈉對(duì)熒光假單胞菌AR4進(jìn)行固定化。

        表1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞固定化效果的影響Table 1 Effect of sodium alginate concentration on cell immobilization

        2.2 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的比較

        圖1 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的比較Fig.1 Comparative production of 2-keto-D-gluconic acid by immobilized cells and free cells

        由圖1可知,發(fā)酵60h時(shí),游離細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度已經(jīng)達(dá)到13.30g/100mL,對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到88.0%以上,其發(fā)酵已接近終點(diǎn),而此時(shí)固定化細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度只有10.84g/100mL,對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率約為72.0%,說(shuō)明固定化細(xì)胞的產(chǎn)酸速率較游離細(xì)胞慢;發(fā)酵72h時(shí),游離細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度幾乎沒(méi)有明顯變化,而固定化細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度明顯增加至13.26g/100mL,對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率接近88.0%,說(shuō)明固定化細(xì)胞具有與游離細(xì)胞相似的生產(chǎn)2KGA的能力。繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,游離細(xì)胞及固定化細(xì)胞發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度均無(wú)明顯增加,故將發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為72h。

        2.3 玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響

        圖2 玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)2KGA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of corn steep liquor concentration on 2-keto-D-gluconic acid production

        圖2表明,玉米漿質(zhì)量濃度過(guò)大或過(guò)小均不利于固定化細(xì)胞2KGA的生產(chǎn)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿的質(zhì)量濃度為0.75g/100mL時(shí),固定化熒光假單胞菌AR4的2KGA產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率最高。有實(shí)驗(yàn)[15]表明,培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度為14.0g/100mL時(shí),游離細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的最適玉米漿質(zhì)量濃度為1.5g/100mL左右。產(chǎn)生上述差異的原因可能是:固定化細(xì)胞在發(fā)酵前已經(jīng)經(jīng)過(guò)增殖,對(duì)氮源的需求量與游離細(xì)胞不同;游離細(xì)胞生長(zhǎng)需要大量氮源,而固定化細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢,其氮源主要用于維持自身生理代謝??傮w上講,利用固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA所需的氮源量相對(duì)較少,有利于節(jié)約成本和發(fā)酵產(chǎn)物提取。

        2.4 發(fā)酵溫度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響

        發(fā)酵溫度對(duì)2KGA生產(chǎn)具有明顯的影響。發(fā)酵溫度過(guò)低,發(fā)酵周期明顯延長(zhǎng);發(fā)酵溫度過(guò)高,產(chǎn)物對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率降低[16]。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,采用熒光假單胞菌AR4工業(yè)生產(chǎn)2KGA的發(fā)酵溫度一般控制在33~36℃。本實(shí)驗(yàn)采用玉米漿質(zhì)量濃度為0.75g/100mL的發(fā)酵培養(yǎng)基,在30~40℃的溫度范圍內(nèi)考察發(fā)酵溫度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響。

        圖3 發(fā)酵溫度對(duì)固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on 2-keto-D-gluconic acid production by immobilized cells

        圖3結(jié)果表明,隨著發(fā)酵溫度升高,2KGA產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率逐漸下降。30~36℃固定化細(xì)胞的產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率較高,分別達(dá)到13.40~13.60g/100mL和88.78%~90.11%,表明固定化細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度為30~36℃,與游離細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度相近。發(fā)酵溫度升至38℃時(shí),2KGA產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率明顯降低,但仍分別達(dá)到12.87g/100mL和85.31%,說(shuō)明AR4菌株生產(chǎn)性能穩(wěn)定,產(chǎn)酸溫度范圍廣,具有較好的高溫發(fā)酵能力。

        表2 重復(fù)利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)2KGA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Effect of repeated use of immobilized cells on 2-ket-D-gluconic acid production

        2.5 固定化細(xì)胞的重復(fù)利用

        固定化細(xì)胞被重復(fù)使用7次后,可能受到發(fā)酵液中離子腐蝕效應(yīng)的影響,其機(jī)械強(qiáng)度明顯下降,約有10%~20%的凝膠顆粒出現(xiàn)破裂現(xiàn)象,表現(xiàn)為發(fā)酵液中的菌體生長(zhǎng)量明顯增加,但其2KGA的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率沒(méi)有發(fā)生明顯變化(表2)。

        3 結(jié) 論

        使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%海藻酸鈉制備的固定化細(xì)胞穩(wěn)定性好,可重復(fù)利用7次左右;固定化熒光假單胞菌AR4的產(chǎn)酸能力與其游離細(xì)胞基本相同,但產(chǎn)酸速率略低于游離細(xì)胞;固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的適宜溫度為30~36℃,與其游離細(xì)胞的適宜發(fā)酵溫度相近;固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的氮源需求量明顯低于其游離細(xì)胞,有利于生產(chǎn)成本的降低及發(fā)酵產(chǎn)物的提取。

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        Production of 2-Keto-D-Gluconic Acid Using ImmobilizedPseudomonas fluorescensAR4

        CHEN Ping1,MIAO Xiao-yan1, ZHANG Xiao-mei1,ZHOU Qiang2,SUN Wen-jing2,3,*
        (1. Department of Biochemistry, Baoding University, Baoding 071000, China;2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China;3. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

        TQ814.2

        A

        1002-6630(2010)21-0258-04

        2010-08-27

        江蘇大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(08JDG029);江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00600);江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(贛財(cái)教[2008]147號(hào))

        陳萍(1959—),女,副教授,研究方向?yàn)樯锟茖W(xué)。E-mail:xiaopuchen123@eyou.com

        *通信作者:孫文敬(1964—),男,研究員,博士,研究方向?yàn)樯锘?。E-mail:sunwenjing1919@163.com

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