高 莉，王 強(qiáng)，帕提古力·瑪合木提,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化性質(zhì)測(cè)試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

核桃隔膜多糖的分離純化及單糖組成分析

高 莉1，王 強(qiáng)2，帕提古力·瑪合木提1,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化性質(zhì)測(cè)試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

目的：分離純化核桃隔膜多糖并分析其單糖組成。方法：核桃隔膜經(jīng)水提醇沉、冷凍干燥得水溶性多糖，經(jīng)DEAE-纖維素52離子柱和SephadexG-100凝膠柱分離純化后得到多糖組分PDJL-A11(diaphragma ofjuglans regiaL. acid polysaccharide)。運(yùn)用紫外光譜鑒定純度，氣相色譜分析多糖的單糖組成。結(jié)果：核桃隔膜多糖PDJL-A11單糖組成為：阿拉伯糖、果糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量比為2.11:6.52:8.81:12.59:15.58。結(jié)論：建立了核桃隔膜多糖分離純化的方法，確定了其單糖組成及其物質(zhì)的量比、可為核桃隔膜藥理學(xué)的研究提供參考。

核桃隔膜；多糖；純化；氣相色譜；單糖組成

Abstract：The purpose of this work was to isolate and purify polysaccharide from diaphragma ofJuglans regiaL (PDJL) and analyze its monosaccharide composition. A water-soluble crude polysaccharide was obtained by water extraction, ethanol precipitation and freeze-drying. The crude polysaccharide was purified to obtain a fraction of PDJL-A11 on DEAE-cellulose52 column and SephadexG-100 column. The purity of PDJL-A11 was analyzed by UV spectrophotometer. The monosaccharide composition and molecular ratio of PDJL-A11 were analyzed by gas chromatography. The monosaccharide composition of PDJLA11was composed of arabinose, fructose, mannose, rhamnose and glucose with a molar ratio of 2.11:6.52:8.81:12.59:15.58.

Key words：diaphragma ofJuglans regiaL.；polysaccharide；purification；gas chromatography；monosaccharide composition

核桃隔膜(diaphragma ofJuglans regiaL.)又名核桃分心木，為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物核桃的帶骨質(zhì)內(nèi)果皮的種隔[1]。在維吾爾族民間常用它泡服，具有補(bǔ)腎澀精、治療多汗、尿頻、遺尿、口腔潰瘍、牙齦出血等多重功效[2-3]。相關(guān)研究表明[4]，核桃隔膜中含有蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、有機(jī)酸、強(qiáng)心苷、甾類、皂苷等多種化學(xué)成分。而目前，對(duì)于其化學(xué)成分的研究?jī)H限于黃酮、色素和揮發(fā)油。多糖作為一種重要的活性成分，除了有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老的生理功能外，還有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗凝血等作用[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用離子交換和凝膠層析對(duì)核桃隔膜多糖提取物分離純化，紫外光譜和凝膠層析鑒定純度，采用氣相色譜對(duì)PDJL-A11的單糖組分進(jìn)行分析，以期為核桃隔膜多糖的結(jié)構(gòu)解析、構(gòu)效關(guān)系及生物活性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃隔膜(和田薄皮核桃)購(gòu)于烏魯木齊市二道橋。

DEAE-cellulose52、SephadexG-100 Whatman公司；葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖 上海試劑公司；無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、氯化鈉、鹽酸、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐、碳酸鋇、肌醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S24可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)水式真空泵、HH-S型水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；D-37520離心機(jī) 德國(guó)Kendro公司；ALPHA1-2LD真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；HT6890氣相色譜儀 美國(guó)Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃隔膜粗多糖的提取

精確稱取100g經(jīng)過(guò)脫脂處理的核桃隔膜干粉，90%乙醇300mL在95℃提取2h，抽濾，濾渣揮干溶劑，按水料比1:80(m/V)、溫度90℃，水浴浸提180min，抽濾，濾渣可用少量溫水沖洗，得到核桃隔膜可溶性多糖浸提液。將多糖浸提液60℃真空濃縮成小體積，按體積比3:1加入Sevag混合液(氯仿與正丁醇體積比為4:1)，劇烈振蕩20min后，4000r/min離心15min，收集上清液，仍按體積比3:1加入Sevag混合液，重復(fù)10～13次至中間層無(wú)變性蛋白。收集上清液，加入3倍體積的無(wú)水乙醇置4℃冰箱過(guò)夜，5000r/min離心5min沉淀多糖，沉淀用乙醚和丙酮各洗滌兩次，真空冷凍干燥，稱質(zhì)量，備用。

1.3.2 核桃隔膜粗多糖的純化

1.3.2.1 DEAE-纖維素52柱層析[7-8]

柱規(guī)格為3cm×39.5cm，有效柱長(zhǎng)15.5cm，50mg/mL糖液上樣6mL，采用0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫?？刂屏魉?.5mL/min，5mL/管。蒽酮-硫酸法[9]隔管跟蹤檢測(cè)多糖流出部位，收集同一洗脫峰的多糖樣品，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，多糖洗脫液的吸光度為縱坐標(biāo)，做洗脫曲線。

1.3.2.2 Sephadex G-100柱層析[10]

將DEAE-纖維素52柱層析洗脫組分經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后配成20mg/mL溶液，上樣4mL，用0.1mol/L NaCl溶液洗脫，柱規(guī)格為2cm×40cm，有效柱長(zhǎng)25.5cm，流速為0.2mL/min，3mL/管。蒽酮-硫酸法[9]隔管跟蹤檢測(cè)多糖流出部位，收集同一洗脫峰的多糖樣品，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，多糖洗脫液的吸光度為縱坐標(biāo)，做洗脫曲線。

1.3.3 亞級(jí)組分PDJL-A11純度鑒定

1.3.3.1 SephadexG-100純度鑒定

經(jīng)過(guò)SephadexG-100分離純化后的亞級(jí)組分5mg溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，上樣1mL，0.1mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.1mL/min，2mL/管。

1.3.3.2 紫外光譜純度鑒定

SephadexG-100分離純化后的亞級(jí)組分PDJL-A11，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后配成0.5mg/mL溶液，在UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上從波長(zhǎng)200nm掃描到600nm，蒸餾水作空白對(duì)照，檢測(cè)有無(wú)核酸(波長(zhǎng)260nm處)和蛋白質(zhì)(波長(zhǎng)280nm處)特征吸收峰。

1.3.4 單糖組成分析

1.3.4.1 樣品完全酸水解[11]

精確稱取20mg PDJL-A11置于安醅瓶中，加入2mol/L硫酸溶液5mL，酒精噴燈真空封管，置于烘箱里110℃水解6h，取出冷卻至室溫后加入BaCO3粉末靜置過(guò)夜，待其中和至中性，離心除去BaCO3沉淀，取上清液，冷凍干燥得到樣品單糖混合物，備用。

1.3.4.2 內(nèi)標(biāo)肌醇六乙酸酯的制備[12]

稱取3g肌醇，加入4.5g鹽酸羥胺，45mL醋酸酐和3mL吡啶，在90℃水浴中加熱2h并不斷攪拌。將反應(yīng)液冷卻至室溫后倒入50mL冰水，使肌醇六乙酸酯析出。過(guò)濾后加20mL水洗滌，將壓干后產(chǎn)物放入100℃烘箱中烘干備用。制備的肌醇六乙酸酯用氣相色譜檢驗(yàn)應(yīng)呈現(xiàn)單峰。

1.3.4.3 糖腈乙酰酯衍生物的制備

精確稱取水解后的樣品單糖混合物10mg，鹽酸羥胺10mg，內(nèi)標(biāo)7mg，加入0.5mL吡啶，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30min并振蕩。取出冷卻至室溫，加入0.5mL醋酸酐，在90℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30min進(jìn)行乙酰化，取清液進(jìn)行氣相色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酰酯衍生物采用同法制備。

1.3.4.4 氣相色譜條件

HT6890氣相色譜儀配備HP-5石英毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，程序升溫：柱初溫190℃，保留2min，以5℃/min升溫至230℃，保留5min；汽化室溫度：230℃；進(jìn)樣量：1μL；分流比30:1；載氣N2：1mL/min；H2：30mL/min；空氣：300mL/min。

1.3.4.5 氣相色譜定性定量分析[13-14]

將樣品與標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜峰保留值進(jìn)行對(duì)照以確定樣品中單糖的種類，采用內(nèi)標(biāo)法根據(jù)內(nèi)標(biāo)物和試樣的質(zhì)量以及內(nèi)標(biāo)物和被測(cè)組分的峰面積求出樣品中單糖的含量及物質(zhì)的量比。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-纖維素52柱層析

由圖1可知，用水洗脫獲得了一種中性多糖組分，命名為PDJL-W。由圖2可知，NaCl溶液梯度洗脫出現(xiàn)了3種酸性多糖組分，按照出峰順序分別命名為PDJL-A1、PDJL-A2、PDJL-A3。由于其余組分含量較低，很難收集足夠的量進(jìn)行后續(xù)研究，所以通過(guò)DEAE-纖維素52柱層析只對(duì)PDJL-A1組分進(jìn)行下一步Sephadex G-100的分離純化。

圖1 核桃隔膜多糖DEAE-cellulose52柱層析水洗脫曲線圖Fig.1 Water elution curve of PDJL on DEAE-52 column

圖2 核桃隔膜多糖DEAE-cellulose52柱層析鹽洗脫曲線圖Fig.2 Salt elution curve of PDJL on DEAE-52 column

2.2 Sephadex G-100柱層析

圖3 核桃隔膜多糖PDJL-A1-Sephadex G-100柱層析鹽洗脫曲線Fig.3 Salt elution curve of PDJL-A1on Sephadex G-100 column

由圖3可知，在17管左右形成了一個(gè)明顯的主峰，但在此峰峰腰處即29管處出現(xiàn)了一個(gè)小峰。說(shuō)明PDJL-A1中含有兩種分子質(zhì)量相差不太大的多糖組分，在凝膠柱上分離效果不好。為了能夠得到分子質(zhì)量比較均一的多糖，只收集1～27管洗脫液做后續(xù)研究，并將其命名為PDJL-A11。

2.3 核桃隔膜多糖PDJL-A11純度鑒定

2.3.1 Sephadex G-100純度鑒定

圖4 PDJL-A11的Sephadex G-100純度鑒定Fig.4 Purity identification of PDJL-A11on Sephadex G-100 column

將PDJL-A11溶解于0.1mol/L NaCl溶液中，通過(guò)Sephadex G-100層析柱洗脫得到了一個(gè)單一對(duì)稱峰。(圖4)說(shuō)明通過(guò)分離純化得到的核桃隔膜酸性多糖PDJL-A11樣品是均一的純多糖，可以對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的研究。

2.3.2 紫外光譜純度鑒定

圖5 PDJL-A11的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.5 UV-visible spectrum of PDJL-A11

如圖5所示，PDJL-A11的紫外光譜圖在紫外光區(qū)波長(zhǎng)280nm處和可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明不含蛋白質(zhì)和色素，波長(zhǎng)260nm處有一個(gè)較小的吸收峰，說(shuō)明其組分含有少量核酸。

2.4 單糖組成分析

7種標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙?；苌锏腉C分析結(jié)果見(jiàn)表1，樣品單糖組成的GC分析結(jié)果見(jiàn)圖6。

表1 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酰化衍生物的GC分析結(jié)果Table 1 GC analytical data of seven monosaccharide standards

圖6 樣品單糖組成的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram showing the monosaccharide composition of PDJL-A11

將樣品的氣相色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖進(jìn)行對(duì)照，通過(guò)保留時(shí)間和峰面積對(duì)樣品中的單糖進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以確定樣品PDJL-A11中含有葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖5種單糖，并計(jì)算得阿拉伯糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖的物質(zhì)的量之比為2.11:6.52:8.81:12.59:15.58。

表2 PDJL-A11的GC分析結(jié)果Table 2 GC analytical data of PDJL-A11

3 結(jié) 論

本研究采用DEAE-cellulose52陰離子交換樹(shù)脂和葡聚糖凝膠G-100層析柱從核桃隔膜中分離、純化得到了一種酸性多糖PDJL-A11。通過(guò)凝膠層析和紫外光譜分析，表明PDJL-A11為均一多糖組分。運(yùn)用氣相色譜分析時(shí)，由于多糖本身不具有揮發(fā)性，所以選擇將其轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、對(duì)熱穩(wěn)定的糖腈乙酸酯衍生物。該法具有操作方便、定性簡(jiǎn)單可靠、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

通過(guò)氣相分析，確定PDJL-A11由葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖5種單糖組成，并計(jì)算得出阿拉伯糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖的物質(zhì)的量之比為2.11:6.52:8.81:12.59:15.58。

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Isolation, Purification and Monosaccharide Composition Analysis of Polysaccharide from Diaphragma ofJuglans regiaL.

GAO Li1，WANG Qiang2，PATIGUL Mahmut1,*
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University,rmqi 830046, China；2. Test Center of Physical and Chemical Characteristic, Xinjiang University,rmqi 830046, China)

TS201.23

A

1002-6630(2010)21-0182-04

2010-02-06

高莉(1984—)，女，碩士，主要從事資源植物成分分析研究。E-mail：gaoli40130@163.com

*通信作者：帕提古力·瑪合木提(1959—)，女，教授，本科，主要從事資源植物成分研究。E-mail：patigulimahemuti@126.com