李倩，寧德剛，吳春篤

1 江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013 2 江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江 212013

以CotX為分子載體在枯草芽胞桿菌芽胞表面展示綠色熒光蛋白

李倩1,2，寧德剛1，吳春篤1

1 江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013 2 江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江 212013

芽胞衣殼蛋白CotB、CotC、CotG等可作為芽胞表面展示外源蛋白的分子載體，制備口服重組疫苗或具有催化活性的重組酶。CotX為枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis芽胞衣殼中的另一種結(jié)構(gòu)蛋白。為證明CotX能否作為分子載體將外源蛋白展示在芽胞表面，本研究將 cotX基因與綠色熒光蛋白基因 gfp的編碼序列進(jìn)行基因重組，構(gòu)建融合表達(dá)CotX-GFP的整合型重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌，篩選重組菌株并誘導(dǎo)產(chǎn)生芽胞，觀察到重組芽胞表面具有GFP綠色熒光。結(jié)果表明枯草芽胞桿菌的芽胞衣殼蛋白CotX位于芽胞衣殼外層，可作為芽胞表面展示外源蛋白的載體分子。

枯草芽胞桿菌，芽胞表面展示，CotX，綠色熒光蛋白

Abstract:Spore coat proteins, such as CotB, CotC, CotG et al, are able to efficiently display exogenous protein on spore surface for preparing oral vaccines or enzymes.CotX is another structural protein of spore coats of Bacillus subtilis.To investigate whether CotX could carry target protein onto the spore surface, we constructed a recombinant integrative plasmid, designated as pJS749,which carries a recombinant cotX-gfp gene under the control of the cotX promoter.We transformed pJS749 into Bacillus subtilis 168(trp-), an α-amylase inactivated mutant DRJS749 was selected and confirmed to be a double crossover integrant, where cotX-gfp fragment was integrated into the chromosome.After induction of spore formation, significant green fluorescence was observed on spore surface of strain DRJS749 under fluorescent microcopy.This suggests that CotX is associated with the outer part of the coat.CotX can therefore be used as a molecular vehicle for spore surface display of exogenous proteins.

Keywords:Bacillus subtilis, spore surface display, CotX, GFP

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis在營養(yǎng)缺乏等逆境條件誘導(dǎo)下，營養(yǎng)細(xì)胞分化形成休眠體——芽胞。芽胞由皮層、芽胞衣殼和芽胞外壁構(gòu)成。外層的芽胞衣殼主要由疏水的衣殼蛋白構(gòu)成，具有抗酶解、抗藥物功能。芽胞的形成是一系列調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因按一定時序調(diào)控表達(dá)的過程。這些基因包括芽胞衣殼蛋白基因以及調(diào)控基因，如cotA、cotB、cotC、cotF、cotG 等20余種[1]。由于芽胞的特殊結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的抗逆性，能在極端環(huán)境(如高溫、干燥、化學(xué)藥物)中長期存活，能順利通過動物消化道屏障等特點(diǎn)，以芽胞衣殼蛋白為分子載體，通過芽胞表面展示技術(shù)將外源目的蛋白展示于重組枯草芽胞桿菌芽胞表面，制備具有生物活性的重組芽胞的研究倍受關(guān)注[2-3]。已有報道成功利用枯草芽胞桿菌芽胞衣殼蛋白CotB[4]、CotC[5]以及CotG[6]為分子載體，將具有免疫保護(hù)作用的抗原蛋白或酶展示于芽胞表面，構(gòu)建具有免疫學(xué)功能或催化活性的重組芽胞。

由于不同的芽胞衣殼蛋白的分子結(jié)構(gòu)，以及在芽胞中的組成存在差異，導(dǎo)致不同的芽胞衣殼蛋白作為分子載體表面展示外源蛋白的重組芽胞生物學(xué)活性也不同[4-5]；利用芽胞表面展示技術(shù)同時展示多種不同抗原蛋白或酶，制備多價重組抗原疫苗或不同催化酶的重組芽胞，需要多種具有運(yùn)載功能的衣殼蛋白作為載體。但在已報道的20余種枯草芽胞桿菌芽胞衣殼蛋白中，只有部分衣殼蛋白位于芽胞衣殼的外層，但它們在芽胞衣殼中的準(zhǔn)確位置以及暴露于芽胞表面的結(jié)構(gòu)域并不清楚[1]，能否作為分子載體將外源蛋白展示于芽胞表面需要通過實驗證明。因此，篩選新的能有效展示外源目的蛋白的載體分子，用于芽胞表面展示外源蛋白尤為關(guān)鍵。本研究以綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因(gfp)為報告基因，以枯草芽胞桿菌芽胞衣殼蛋白CotX為分子載體，通過芽胞表面展示技術(shù)將GFP展示于芽胞表面。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

用于質(zhì)?？寺〉乃拗骶?E.coli DH5α在37℃LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，含有質(zhì)粒的大腸桿菌加入相應(yīng)的抗生素(氨芐青霉素工作濃度均為 50 μg/mL)。Bacillus subtilis 168(trp-)來源于 Bacillus Genetic Stock Center，Department of Biochemistry，The Ohio State University。質(zhì)粒 pBAD-gfpuv[7]由中國科學(xué)院水生生物研究所徐旭東研究員提供。pJS700a由本實驗室構(gòu)建，其他質(zhì)粒均為本實驗室保存。

1.2 分子生物學(xué)操作

DNA重組按標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行[8]，枯草芽胞桿菌染色體的提取參照文獻(xiàn)[9]。PCR反應(yīng)體系中含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50 mmol/L MgCl2，引物各 100 pmol，200 μmol/L dNTPs，50 ng 模板 DNA，2.5 U DNA聚合酶。反應(yīng)程序為：94℃變性5 min；94℃1 min，58℃ 1 min，72 ℃ 1 min ，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。含gfp編碼序列的片段以gfp-a(5′-GGTAC CGCTAGCAAAGGAGAAG-3′)、gfp-b(5′-GAATTCT GCAGGTCGACTCTAGAGG-3′) 為 引 物 ， pBADGFPuv為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。含 cotX的片段以cotX-a(5′-GTCTAGATTACTTTGTCTGCCGACGAGA-3′)、cotX-b(5′-GGTACCGAGGACAAGAGTGATAA CTAGGATG-3′)為引物，以 Bacillus subtilis 168(trp-)染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)回收后用于克隆。用于枯草芽胞桿菌重組菌株鑒定的引物為 amyE-11:5′-GAGATCTC ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG-3′和 amyE-22:5′-GTTACACCATCACTGTTCGTTCC-3′。反應(yīng)程序為：94℃變性 5 min；94 ℃ 1 min ，58 ℃ 1 min ，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pMD-18T等均購自寶生物(大連)有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，來源于PCR產(chǎn)物的克隆片段由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序確定。

1.3 枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化

以兩步法制備Bacillus subtilis 168(trp-)感受態(tài)細(xì)胞[10]，枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。用含0.4 μg/mL紅霉素的LB平板于37℃培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子。

1.4 枯草芽胞桿菌淀粉酶活性分析

從平板上挑枯草芽胞桿菌單菌落接種在 3 mL液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取5 μL菌液涂于含1%淀粉的LB平板上，37℃培養(yǎng)16 h，取2 mL碘液噴于淀粉平板上，并對染色平板拍照。碘液的配制：碘化鉀2 g，碘1 g，先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，待全溶解后再加碘，振蕩溶解后稀釋至300 mL，保存在棕色玻璃瓶內(nèi)。

1.5 枯草芽胞桿菌芽胞的誘導(dǎo)和顯微拍攝

以 DSM培養(yǎng)基誘導(dǎo) Bacillus subtilis 168(trp-)或重組菌株DRJS749形成芽胞[9]。DSM培養(yǎng)基的配制：0.8%肉湯營養(yǎng)液(Difco)，0.1% KCl，0.025%MgSO4·7H2O，1.0 mmol /L Ca(NO3)2，10 μmol /L MnCl2，1.0 μmol/L FeSO4。取 Bacillus subtilis 168(trp-)或重組菌株DRJS749單菌落接種于3 mL DSM 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)40 h，5000 r/min離心10 min收集芽胞，重懸于1 mL無菌水中。以終濃度為2 mg/mL溶菌酶37℃處理30 min破壞營養(yǎng)細(xì)胞，5000 r/min離心10 min沉淀芽胞，加1 mL水重懸芽胞。取10 μL芽胞懸液涂于載玻片上，蓋上蓋玻片，利用裝置在Leica DFC300FX 熒光顯微鏡上的 LEICA QWIN LITE 圖像分析軟件輔助的 Leica DFC300FX冷 CCD數(shù)碼攝像頭進(jìn)行拍攝。GFP 熒光通過 Sapphire GFP 濾光片組件(激發(fā)光濾光片BF470/40，dichromatic mirror：500，發(fā)射光濾片：BP 525/50)觀察，拍攝快門速度為270 ms。

2 結(jié)果

2.1 融合表達(dá)CotX-GFP的整合型重組質(zhì)粒及重組菌株的構(gòu)建策略

為證明 CotX能否作為載體將外源蛋白展示于芽胞表面，以 gfp為報告基因，構(gòu)建融合表達(dá)CotX-GFP的整合型重組質(zhì)粒(圖1)。在枯草芽胞桿菌整合平臺質(zhì)粒 pJS700a中，含 Bacillus subtilis 168(trp-)淀粉酶基因 amyE 片段(547～1643 nt)，在該片段中的Sma I位點(diǎn)插入紅霉素抗性基因Emr，下游含多克隆位點(diǎn)。分別將cotX及gfp編碼序列插入pJS700a中，得到含融合表達(dá)CotX-GFP的整合型重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌，通過質(zhì)粒上的 amyE 片段與宿主染色體上的同源片段雙交換重組獲得枯草芽胞桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生重組芽胞，觀察重組芽胞表面GFP的表達(dá)。

2.2 重組質(zhì)粒pJS747的構(gòu)建

根據(jù) Bacillus subtilis 168染色體上的 cotX(GenBank Accession No.NP_389058)序列，設(shè)計并合成引物cotX-a和cotX-b。為便于克隆，上游引物cotX-a添加了Xba I位點(diǎn)，下游引物cotX-b添加了Kpn I位點(diǎn)。以 cotX-a和 cotX-b為引物，Bacillus subtilis 168(trp-)染色體DNA為模板，擴(kuò)增含cotX基因的啟動子和不含終止密碼子的編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為890 bp，回收并克隆于pMD-18T載體中，測序確定克隆片段正確后命名pJS738。以Xba I和Kpn I完全酶切 pJS738，回收 cotX片段，克隆于pJS700a相應(yīng)位點(diǎn)，重組質(zhì)粒命名為pJS747(圖2)。

2.3 融合表達(dá)CotX-GFP整合型重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以gfp-a和gfp-b為引物，質(zhì)粒pBAD-GFPuv 為模板，擴(kuò)增含gfp基因的編碼序列片段(約774 bp)，并克隆于pMD-18T載體中，測序確定序列正確后命名為pJS289。以Kpn I和EcoR I完全酶切pJS289，回收gfp片段，并克隆于pJS747相應(yīng)的位點(diǎn)，使cotX和 gfp的編碼序列處于同一閱讀框中，得到的整合型重組質(zhì)粒命名為pJS749(圖2)。該質(zhì)粒中含來自Bacillus subtilis 168(trp-)染色體上的淀粉酶基因的5′端和 3′端的 DNA 片段；供 Bacillus subtilis 168(trp-)轉(zhuǎn)化子篩選的紅霉素抗性基因 Emr；以及融合表達(dá)CotX-GFP的重組基因片段，該片段含cotX啟動子序列、不含cotX終止密碼子的CotX編碼序列和GFP的全編碼序列，該重組基因由cotX啟動子控制，在誘導(dǎo)芽胞分化時融合表達(dá)CotX-GFP。

2.4 融合表達(dá) CotX-GFP重組枯草芽胞桿菌的構(gòu)建

為構(gòu)建融合表達(dá) Cotx-GFP的重組枯草芽胞桿菌，以BglⅡ酶切質(zhì)粒pJS749使其線形化，并轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168(trp-)。因重組質(zhì)粒上的整合片段可與染色體上的同源片段雙交換重組，淀粉酶基因因插入重組片段 Emr-cotX-gfp失活，融合表達(dá)CotX-GFP的重組基因整合于染色體上(圖4A)。為篩選 Emr-cotX-gfp插入淀粉酶基因 amyE中的轉(zhuǎn)化子，將其接種于淀粉平板，培養(yǎng)后以碘液染色，轉(zhuǎn)化子及其周圍被碘液染成藍(lán)色，對照菌株 Bacillus subtilis 168(trp-)菌落及周圍產(chǎn)生透明的淀粉水解圈(圖3)。表明轉(zhuǎn)化子中的淀粉酶基因失活，Emr-cotX-gfp片段通過插入淀粉酶基因而整合于重組菌株的染色體上。

圖1 融合表達(dá)CotX-GFP的整合型重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1 Construction of integrative recombinant plasmid for fusion expression of CotX-GFP.amyE 5'-end and amyE 3'-end are integrative fragments from amylase gene of Bacillus subtilis 168(trp-), Emr: gene resistant to erythromycin; Apr: gene resistant to penicillin; OriC:replication origin of E.coli.

圖2 重組質(zhì)粒pJS738和pJS749的鑒定Fig.2 Examination of plasmid pJS738 and pJS749 by PCR and enzyme digestion.1: λDNA/Hind Ⅲ; 2: pJS700a digested by BamH I; 3: pJS747 digested by BamH I; 4: pJS749 digested by BamH I; 5: identification of pJS747 by PCR using cotX-a/cotX-b as primers; 6: identification of pJS749 by PCR using cotx-a/gfp-b as primers.

為進(jìn)一步證明重組菌株中淀粉酶基因的失活是由于 Emr-cotX-gfp的插入所致，分別以 amyE-11/amyE-22、cotX-a/gfp-b為引物，染色體為模板，PCR擴(kuò)增鑒定重組菌株，分別檢測到約4.0 kb和1.7 kb的擴(kuò)增片段。表明重組菌株染色體上含有 cotX-gfp重組基因，并且Emr-cotX-gfp重組片段插入淀粉酶基因中(圖4)。將鑒定后的轉(zhuǎn)化子命名為DRJS749。

2.5 表面展示gfp的重組芽胞鑒定

圖3 重組菌株DRJS749淀粉酶活性分析Fig.3 Identification of DRJS749 by analysis of amylase activity.(A)Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749 were grown on LB plates containing 1% starch.(B)The plate was stained with iodine to detect the a-amylase activity, which was indicated by the transparent plaque.

將重組菌株DRJS749接于DSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別于20 h和40 h取菌液滴于載玻片上，以Bacillus sutilis 168(trp-)為對照，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。培養(yǎng) 20 h的重組菌株 DRJS749和 Bacillus sutilis 168(trp-)均為營養(yǎng)細(xì)胞，熒光顯微鏡下均未觀察到綠色熒光(數(shù)據(jù)未顯示)；而培養(yǎng)40 h后細(xì)胞分化成芽胞，重組菌株DRJS749的芽胞表面具有顯著的綠色熒光；在相同的條件下，Bacillus sutilis 168(trp-)芽胞未見綠色熒光(圖6)。表明重組菌株營養(yǎng)細(xì)胞不表達(dá)GFP；當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生芽胞時，在cotX啟動子控制下表達(dá)CotX-GFP，GFP通過芽胞衣殼蛋白CotX展示于芽胞表面。

圖4 菌株DRJS749中重組基因片段的鑒定Fig.4 Identification of the recombinant fragment of DRJS749.(A)Schematic diagram of the integration of Emr-cotX-gfp in chromosome.(B)PCR examination of Emr-cotX-gfp fragment integrated into the chromosome of Bacillus subtilis 168(trp-).1:λDNA/Hind Ⅲ; 2, 3: Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749, using amyE-11/amyE-22 as primers; 4: examination of cotX-gfp fragment of DRJS749 using primer cotX-a/gfp-b.

圖5 重組菌株DRJS749芽胞表面GFP的熒光檢測Fig.5 Detection of GFP fluorescence on spore surface of DRJS749.(A, C)Bright-field images of Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749(10×100 oil lens), respectively.(B, D)GFP fluorescence images of Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749(10 × 100 oil),respectively.

3 討論

用于芽胞表面展示外源蛋白的載體蛋白必須滿足以下條件：位于芽胞衣殼外層的衣殼蛋白；有可融合外源蛋白并暴露于芽胞表面的結(jié)構(gòu)域?？莶菅堪麠U菌芽胞由約20余種衣殼蛋白形成的衣殼包裹，已證明cotA、cotB、CotC、CotF和CotG等組成芽胞衣殼的外層。Isticato等[4]利用CotB作為芽胞表面展示外源抗原的載體蛋白，成功地在枯草芽胞桿菌芽胞表面展示了破傷風(fēng)毒素(TTFC)C末端的 459個氨基酸片段。用芽胞衣殼的另一蛋白成分CotC作為融合載體蛋白，分別將 TTFC和大腸桿菌的不耐熱腸毒素 B亞單位(LTB)展示于芽胞表面。Kwon等[6]以CotG為蛋白載體將半乳糖苷酶展示于枯草芽胞桿菌芽胞表面，重組芽胞在水-有機(jī)相反應(yīng)體系中具有半乳糖苷酶催化活性，并且較化學(xué)方法固定于芽胞表面的半乳糖苷酶有更好的穩(wěn)定性。表明位于芽胞衣殼外層的衣殼蛋白CotB、CotC和CotG可用作芽胞表面展示外源蛋白的載體分子。

CotX是枯草芽胞桿菌芽胞的另一種衣殼蛋白[11]，但在芽胞衣殼外層中的準(zhǔn)確定位以及其暴露于芽胞衣殼外的結(jié)構(gòu)域還不清楚。本研究以CotX作為載體蛋白，以gfp為報告基因，構(gòu)建了含重組基因cotX-gfp的重組枯草芽胞桿菌菌株。重組菌株在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中能以營養(yǎng)細(xì)胞的形式進(jìn)行增殖，在寡營養(yǎng)培養(yǎng)基或營養(yǎng)不足時，可誘導(dǎo)形成芽胞，并且其他生長特征較親本菌株無明顯的改變。誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生芽胞，觀察到重組芽胞表面具有GFP綠色熒光。表明CotX位于枯草芽胞桿菌芽胞衣殼的外層，其C末端的部分氨基酸暴露于芽胞表面；同時，CotX可作為芽胞表面展示外源蛋白的載體分子，這使芽胞表面展示技術(shù)中載體分子有更多的選擇余地，尤其在芽胞表面同時展示多種抗原蛋白或多種酶蛋白，制備多價抗原疫苗或復(fù)合酶催化系統(tǒng)的重組芽胞，具有重要的應(yīng)用價值。但CotX作為載體分子將外源蛋白展示于芽胞表面的運(yùn)載能力，以及展示不同外源蛋白的能力有何差異，有待進(jìn)一步研究。

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Surface display of GFP using CotX as a molecular vector on Bacillus subtilis spores

Qian Li1,2, Degang Ning1, and Chundu Wu1
1 School of Environment, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China 2 Institute of Life Science, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

Received:September 25, 2009;Accepted:November 16, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of Jiangsu Province(No.BK2006075), Postdoctoral Fund of China(No.20070411025).

Corresponding author:Degang Ning.Tel: +86-511-88797818; E-mail: 306502@ujs.edu.cn江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK2006075), 中國博士后基金(No.2007AA021702)資助。