高明波，張衛(wèi)，虞星炬

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 海洋生物產(chǎn)品工程組，大連 116023 2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049 3 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大連 116600 4 澳大利亞Flinders大學(xué) 海洋分子生物過程及生物產(chǎn)品實驗室，阿德萊德 SA 5042

原位吸附和茉莉酸甲酯聯(lián)合使用顯著提高中國紅豆杉細(xì)胞云南紫杉烷c的生產(chǎn)

高明波1,2,3，張衛(wèi)1,4，虞星炬1

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 海洋生物產(chǎn)品工程組，大連 116023 2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049 3 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大連 116600 4 澳大利亞Flinders大學(xué) 海洋分子生物過程及生物產(chǎn)品實驗室，阿德萊德 SA 5042

本實驗所用的中國紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中，云南紫杉烷c(Tc)是主要的次生代謝產(chǎn)物，該化合物有類神經(jīng)生長因子活性，提高其產(chǎn)量是進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)的前提。本研究考察了原位吸附和茉莉酸甲酯(MJA)聯(lián)合調(diào)控提高Tc產(chǎn)量的可能性。在培養(yǎng)的第7天加入濃度為100 μmol/L的MJA雖然會使細(xì)胞的生物量下降10%～30%，但是單位細(xì)胞內(nèi)Tc含量和Tc產(chǎn)量均有顯著提高，分別是對照的3.6和3.3倍。吸附劑XAD-7在不同時間加入對Tc 的合成影響顯著。在培養(yǎng)的第7天同時加入100 μmol/L的MJA和100 g/L的XAD-7會使細(xì)胞生物量增加，Tc產(chǎn)量顯著提高。培養(yǎng)到第21天，Tc產(chǎn)量達(dá)477.4 mg/L，為對照的6.3倍，為只加MJA的1.9倍，其中94%的Tc被樹脂吸附。實驗結(jié)果表明，在MJA誘導(dǎo)高表達(dá)的過程中，吸附劑XAD-7的加入使細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物外泌，濃度降低，減輕產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象，從而大幅度提高代謝物產(chǎn)量，有較好的生產(chǎn)前景。

中國紅豆杉，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，茉莉酸甲酯，XAD-7，云南紫杉烷c

Abstract:A bioprocess intensification strategy that combines both elicitation and in situ absorption was developed to improve the production of taxuyunnanine c(Tc)in cell suspension cultures of Taxus chinensis.When 100 μmol/L methyl jasmonate was added as an elicitor on Day 7, the Tc content and yield increased 3.6 and 3.3 times respectively, however the cell growth was reduced by 10%?30%.Significant improvement in Tc yield was observed when an absorbent XAD-7 was added on different time of the cultureperiod.The optimum Tc yield was achieved when 100 g/L XAD-7 was added simultaneously with 100 μmol/L methyl jasmonate on Day 7.The maximum Tc yield of 477.4 mg/L was obtained on Day 21 of the culture, being 6.3-fold of the control and 1.9-fold of the 100 μmol/L methyl jasmonate treatment alone.In the combined treatment, 94% of the Tc produced was secreted outside of the cells and absorbed on XAD-7 absorbents.The results demonstrated that the process strategy combining elicitation and in situ absorption was effective to intensify the Tc biosynthesis via elicitation with the removal of product feedback inhibition via absorption,presenting a great potential in commercial applications.

Keywords:Taxus chinensis, cell suspension culture, methyl jasmonate, XAD-7, taxuyunnanine c

植物細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)有價值次生代謝產(chǎn)物的一條有效途徑，但商業(yè)化成功的例子只有紫草細(xì)胞生產(chǎn)紫草素[1]、人參細(xì)胞生產(chǎn)人參皂甙[2]等有限幾個體系，其主要原因是植物細(xì)胞次生代謝物產(chǎn)率和產(chǎn)量均太低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求[3-4]。因此，采用各種調(diào)控手段提高次生代謝物的生產(chǎn)一直是植物細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個熱點[5]。

紫杉醇作為治療晚期卵巢癌、乳腺癌的一線用藥，是迄今為止少數(shù)幾個最具抗癌活性的天然化合物之一[6]。紫杉醇的發(fā)現(xiàn)激勵科學(xué)家投身到紫杉烷類化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷類化合物[7]。已經(jīng)有幾百種紫杉烷從紫杉原植物或細(xì)胞培養(yǎng)液中被分離出來[8]。例如在中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中可大量生產(chǎn)云南紫杉烷c(Tc)，Tc是一種具有類神經(jīng)生長因子活性的新化合物[9]。為提高紫杉醇和紫杉烷類化合物的產(chǎn)量，目前在搖瓶或生物反應(yīng)器水平已經(jīng)開發(fā)出很多提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的技術(shù)[10-14]。

誘導(dǎo)子的篩選和使用是應(yīng)用最廣泛并取得顯著效果的一個策略。在眾多誘導(dǎo)子中，茉莉酸(JA)及其甲酯(MJA)作為一種植物體內(nèi)防御體系的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子，在提高各種紫杉細(xì)胞株紫杉醇及紫杉烷產(chǎn)量上被證明為一個效果顯著的誘導(dǎo)子[15-16]。研究認(rèn)為，紫杉醇和紫杉烷貯存于胞內(nèi)，可能在細(xì)胞壁上[17-18]。使用吸附劑原位吸附技術(shù)如能促進(jìn)胞內(nèi)代謝物外泌，將因吸附產(chǎn)物解除產(chǎn)物的反饋抑制而有利于提高產(chǎn)量；同時也可使目標(biāo)代謝產(chǎn)物純化，便于分離。Kwon等報道過在紫杉細(xì)胞培養(yǎng)第16天加入非離子交換樹脂Amberlite XAD-4會使紫杉醇產(chǎn)量提高40%～70%[19]。Komaraiah在Plumbago rosea(白丹花)細(xì)胞固定化培養(yǎng)生產(chǎn)plumbagin(藍(lán)雪醌)時聯(lián)合使用殼聚糖和XAD-7取得了理想的效果[20]。Choi 在高山唐松草細(xì)胞培養(yǎng)中，使用膜包裹的XAD-7選擇性吸附黃連素，使之與多巴胺分離[21]。但因為XAD在添加和培養(yǎng)后與細(xì)胞分離方面遇到的困難，有關(guān)這項技術(shù)的報道很少[5]。

本實驗選用有效提高植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的MJA作為誘導(dǎo)子，以非離子交換樹脂XAD-7為吸附劑，考察兩種策略聯(lián)合使用對中國紅豆杉細(xì)胞Tc生產(chǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 誘導(dǎo)子和吸附劑

MJA購自Sigma Aldrich；Amberlite XAD-7 購自北京慧德易科技有限責(zé)任公司。

1.2 細(xì)胞株和傳代培養(yǎng)條件

細(xì)胞株由華東理工大學(xué)鐘建江教授提供，在本實驗室傳代培養(yǎng)1年。該細(xì)胞系由中國紅豆杉Taxus chinensis幼莖誘導(dǎo)的愈傷組織懸浮培養(yǎng)而來，已經(jīng)培養(yǎng)了10余年。該細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L NAA、100 mg/L Vc和30 g/L 蔗糖。高壓滅菌前pH調(diào)至5.8。115℃滅菌15 min。傳代細(xì)胞每2周傳1次，在500 mL 三角瓶中裝100 mL 培養(yǎng)基，傳代時將種子細(xì)胞經(jīng)50 μm篩網(wǎng)過濾，細(xì)胞接種密度100 g/L。三角瓶以雙層鋁箔紙封口，置于100 r/min搖床上，(25±1)℃暗培養(yǎng)。

1.3 MJA的添加

有文獻(xiàn)報道，MJA在細(xì)胞培養(yǎng)的第 7天以100 μmol/L的濃度加入對紫杉細(xì)胞紫杉烷的生產(chǎn)最有利，因此本實驗選擇在第7天以100 μmol/L的濃度加入MJA，考察中國紅豆杉細(xì)胞對其響應(yīng)情況。在生物安全柜內(nèi)，取培養(yǎng)14 d的中國紅豆杉種子細(xì)胞，經(jīng)50 μm篩網(wǎng)過濾，精密稱取2 g過濾后的濕細(xì)胞接種至盛裝20 mL上述傳代培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，100 r/min搖床上，(25±1)℃暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至第 7天，向培養(yǎng)基中添加 MJA。事先以無水乙醇為溶劑配好的100 mmol/L MJA經(jīng)0.22 μm PVDF膜過濾除菌，按照1 μL誘導(dǎo)子/mL 培養(yǎng)基的量加入到培養(yǎng)基中，MJA在培養(yǎng)基中的濃度為100 μmol/L。對照組加入等量的無水乙醇。培養(yǎng)后第21天取樣分析。

1.4 XAD-7的預(yù)處理

非離子交換樹脂Amberlite XAD-7 在使用前以分析純甲醇浸泡24 h，中間更換2次甲醇，然后真空抽濾，以重蒸水沖洗多次，115℃高壓滅菌15 min，備用。

1.5 XAD-7在不同培養(yǎng)時間添加

文獻(xiàn)中XAD-7通常的使用量為50～100 g/L，本實驗采用100 g/L。取培養(yǎng)14 d的中國紅豆杉種子細(xì)胞，接種方法和培養(yǎng)條件同上。分別向培養(yǎng)0 d、7 d和12 d的細(xì)胞中加入100 g/L XAD-7。細(xì)胞培養(yǎng)的第7天加入MJA，使其濃度為100 μmol/L，方法同上，對照加入對應(yīng)體積的無水乙醇。培養(yǎng)后第21天取樣分析。

1.6 生物量測定

將取樣細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液真空抽濾，用重蒸水沖洗 3次，洗去細(xì)胞上殘留的培養(yǎng)基，稱重得細(xì)胞鮮重，以FCW(Fresh cell weight)(單位：g/L)表示。鮮細(xì)胞在50℃烘箱中烘48 h至恒重，稱量可得細(xì)胞干重，以DCW(Dry cell weight)(單位：g/L)表示。生物量取樣時間為第7、12、15和21天。

1.7 XAD-7和細(xì)胞的分離

加入XAD-7培養(yǎng)的細(xì)胞，取樣時先讓三角瓶靜置片刻，由于密度差，細(xì)胞和XAD-7會自然分層，細(xì)胞在上層。另取干凈三角瓶，小心將細(xì)胞倒出。分至細(xì)胞和樹脂界面時停止，加入少量重蒸水，使細(xì)胞和樹脂重新分層，如此重復(fù)多次，即可使細(xì)胞和樹脂完全分開。

1.8 Tc的提取和分析

Tc的提取和分析方法參考Qian等[22]的方法。

1.8.1 Tc的提取

取100 mg細(xì)胞干粉(或250 mg XAD-7)加入20倍體積分析純甲醇，室溫靜置提取48 h，超聲2次，每次40 min。提取液經(jīng)4000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管內(nèi)。殘渣以20倍體積分析純甲醇再提取1次。將2次提取液的上清合并，25℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。干粉加入2 mL 二氯甲烷和2 mL重蒸水，充分混勻，4000 r/min離心10 min，上層為水層，以吸管吸凈棄掉。下層為二氯甲烷層，25℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。干粉溶于1 mL色譜純甲醇，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.8.2 Tc的分析

HPLC分析系統(tǒng)為Agilent 1100系列，色譜柱為Alkyl Phenyl 5 μm(4.6 mm×250 mm)(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所103組)。檢測波長227 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，流動相為：58%乙腈：42%水(V/V)，流速1.0 mL/min。

1.8.3 Tc含量、吸附率和產(chǎn)量的計算

Tc含量以單位干細(xì)胞的 Tc量計(單位：mg/g細(xì)胞)，Tc吸附率以單位樹脂內(nèi)吸附的 Tc量計(單位：mg/g樹脂)；Tc產(chǎn)量以單位干細(xì)胞Tc含量乘以細(xì)胞干重計(單位：mg/L)。

2 結(jié)果和分析

2.1 MJA為誘導(dǎo)子對細(xì)胞生長和 Tc生產(chǎn)動力學(xué)的影響

如圖1所示，MJA的加入對中國紅豆杉細(xì)胞的生物量有顯著的影響，在整個細(xì)胞生長周期內(nèi)細(xì)胞鮮重和干重均有一定幅度的下降，下降幅度在 10%～30%左右。

實驗中測定了培養(yǎng)基中Tc的含量，含量甚微，未計在內(nèi)。雖然MJA的加入減少了中國紅豆杉細(xì)胞生物量的積累，但是卻大大提高了單位干細(xì)胞內(nèi)的Tc含量(圖2A)。在培養(yǎng)的第21天，單位干細(xì)胞Tc含量達(dá)到25.2 mg/g DCW，為對照的3.6倍。這樣就彌補(bǔ)了MJA加入后細(xì)胞生物量的下降對Tc產(chǎn)量的負(fù)影響。Tc產(chǎn)量在細(xì)胞培養(yǎng)的第21天達(dá)到249 mg/L，為對照的3.3倍(圖2B)。

2.2 XAD-7在不同時間加入的影響

第7天加入濃度為100 μmol/L的MJA對中國紅豆杉細(xì)胞Tc的含量和產(chǎn)量均有顯著的促進(jìn)作用，后面的實驗除對照外，均在第7天加入MJA，使其在培養(yǎng)液中的濃度為100 μmol/L。

圖1 MJA對中國紅豆杉細(xì)胞鮮重(A)和細(xì)胞干重(B)的影響Fig.1 Effects of MJA on fresh cell weight(A)and dry cell weight(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

MJA和不同時間加入的 XAD-7聯(lián)合使用對中國紅豆杉細(xì)胞生長的影響如圖3所示。在第7天加入MJA的同時若加入濃度為100 g/L的XAD-7，中國紅豆杉細(xì)胞的鮮重和干重不僅沒有被抑制，反而有一定程度的提高。第 0天加入 XAD-7 會嚴(yán)重抑制細(xì)胞的增長，生物量在加入樹脂后的2周內(nèi)基本沒有增加。第12天加入XAD-7也會使細(xì)胞生物量受到抑制，細(xì)胞鮮重和干重下降幅度在40%～50%。

圖4為XAD-7在不同時間加入后，在培養(yǎng)的第21天，單位干細(xì)胞內(nèi)Tc含量(圖4A)及XAD-7 Tc吸附率(圖4B)的情況?？梢钥闯黾尤隭AD-7后，單位細(xì)胞內(nèi)Tc含量均明顯下降；XAD-7 Tc吸附率以第7天加入時最高。到第21天，單位體積培養(yǎng)液內(nèi)的樹脂吸附的Tc已達(dá)到448.1 mg/L，如圖5所示。

圖2 MJA對中國紅豆杉細(xì)胞中Tc含量(A)和Tc產(chǎn)量(B)的影響Fig.2 Effects of MJA on Tc content(A)and Tc yield(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

圖3 MJA和不同時間添加的XAD-7對中國紅豆杉細(xì)胞生長的影響：(A)細(xì)胞鮮重和(B)細(xì)胞干重Fig.3 Effects of MJA and XAD-7 on fresh cell weight(A)and dry cell weight(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

圖4 MJA和不同時間添加的XAD-7對中國紅豆杉細(xì)胞(A)單位干細(xì)胞Tc含量和(B)XAD-7 Tc吸附率的影響Fig.4 Effects of MJA and XAD-7 on Tc content(A)and Tc absorption rate(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

圖5 MJA和不同時間添加的XAD-7對中國紅豆杉細(xì)胞Tc產(chǎn)量及胞內(nèi)外分配的影響Fig.5 Effects of MJA and XAD-7 on Tc production and distribution in the suspension cultures of Taxus chinensis.1:XAD-7 added on Day0; 2: XAD-7 added on Day7; 3: XAD-7 added on Day12.

不同時間加入XAD-7后，Tc總產(chǎn)量的變化情況及胞內(nèi)外分配情況見圖5。第7天加入100 g/L XAD-7和MJA的聯(lián)合作用最為顯著，使Tc產(chǎn)量第21天達(dá)到477.4 mg/L，為對照的6.3倍，為只加MJA的1.9倍。其中94%Tc被吸附到樹脂中。由圖3和圖5可見，細(xì)胞培養(yǎng)第0天加入XAD-7，細(xì)胞生長和生產(chǎn)都處于停滯狀態(tài)，說明XAD-7對靜止期的細(xì)胞有很強(qiáng)的毒害作用。而在細(xì)胞指數(shù)生長初期(第7天)加入的XAD-7可非常有效地將原產(chǎn)胞內(nèi)的Tc吸附出來，從而大大解除產(chǎn)物的反饋抑制，提高Tc的產(chǎn)量。在細(xì)胞代謝高峰期(第12天)加入XAD-7，產(chǎn)物抑制并未解除，后期雖然解除抑制，效果已不突出，從而使Tc產(chǎn)量雖然也有提高，但幅度不大。

3 討論

產(chǎn)量低是植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物難以實現(xiàn)工業(yè)化的主要障礙之一，因此尋求提高植物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝物產(chǎn)量的技術(shù)一直是倍受關(guān)注的焦點，也開發(fā)出了很多有效的技術(shù)[23]。但最初篩選得到的細(xì)胞株生產(chǎn)水平通常都很低，要想使目標(biāo)代謝物產(chǎn)量達(dá)到工業(yè)化水平，只靠一種提高產(chǎn)量的策略難以實現(xiàn)幾個數(shù)量級的飛躍。2種或2種以上增產(chǎn)策略的聯(lián)合使用被證明可以協(xié)同地獲得目標(biāo)代謝物的高水平[5,24-25]。Zhang等[26]同時使用 3種誘導(dǎo)子，Zhong實驗室使用條件培養(yǎng)基和誘導(dǎo)子聯(lián)合作用[27]，誘導(dǎo)子和蔗糖飼喂聯(lián)合作用[28]，誘導(dǎo)子、蔗糖飼喂和乙烯利聯(lián)合作用[29]，Mei實驗室有機(jī)溶劑萃取和蔗糖飼喂聯(lián)合作用[30]在提高紫杉醇或紫杉烷產(chǎn)量上都取得了顯著效果。

本研究考察了在提高植物細(xì)胞次生代謝物產(chǎn)量上具有良好效用的誘導(dǎo)子 MJA和固體吸附劑非離子交換樹脂 XAD-7聯(lián)合使用對中國紅豆杉細(xì)胞液體懸浮系生長和主要產(chǎn)物Tc產(chǎn)量的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國紅豆杉細(xì)胞懸浮系在第 7天加入濃度為100 μmol/L的 MJA時，細(xì)胞生物量會下降 10%～30%左右，但單位細(xì)胞內(nèi)Tc含量和Tc產(chǎn)量均有顯著提高。XAD-7加入時間的實驗均是和第7天加入濃度為100 μmol/L的MJA聯(lián)合進(jìn)行的。實驗結(jié)果表明，第7天同時加入濃度為100 μmol/L的MJA 和100 g/L的XAD-7對中國紅豆杉細(xì)胞的生長和Tc的生產(chǎn)最為有利。培養(yǎng)的第21天，該處理的Tc產(chǎn)量為477.4 mg/L，為對照的6.3倍，為只加MJA的1.9倍，其中94%的Tc被樹脂吸附。本實驗說明，在中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞指數(shù)生長初期加入適當(dāng)濃度的MJA和XAD-7，可以顯著提高Tc的產(chǎn)量。Tc產(chǎn)量提高的原因一方面因為誘導(dǎo)子激發(fā)的信號傳導(dǎo)作用，另一方面是樹脂的吸附避免了產(chǎn)物被降解，同時解除了產(chǎn)物的反饋抑制。另外，因為90%以上Tc被吸附到樹脂中，也很好地解除了Tc在胞內(nèi)時對細(xì)胞生長的抑制，細(xì)胞生物量反而有所增長。

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Enhanced production of taxuyunnanine c in cell suspension cultures of Taxus chinensis by methyl jasmonate elicitation and in situ absorption

Mingbo Gao1,2,3, Wei Zhang1,4, and Xingju Yu1
1 Marine Bioproducts Engineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China 2 Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China 4 Molecular Bioprocessing and Bioproducts Laboratory, Department of Medical Biotechnology, School of Medicine, Flinders University, Adelaide,SA 5042, Australia

Received:September 29, 2009;Accepted:December 24, 2009

Corresponding author:Wei Zhang.Tel/Fax: +86-411-84379069; E-mail: wei.zhang@flinders.edu.au