劉興茂，劉紅，葉玲玲，李世崇，吳本傳，王海濤，謝靖，陳昭烈

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

CHO工程細(xì)胞無血清懸浮分批培養(yǎng)的生長代謝特征及動(dòng)力學(xué)模型

劉興茂，劉紅，葉玲玲，李世崇，吳本傳，王海濤，謝靖，陳昭烈

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

以懸浮適應(yīng)的表達(dá)尿激酶原CHO工程細(xì)胞為研究對(duì)象，在100 mL的搖瓶中進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，以細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、Pro-UK活性、葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生產(chǎn)速率(qlac)、乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)(Ylac/glc)為觀察指標(biāo)，同時(shí)以細(xì)胞有血清懸浮培養(yǎng)作為參照，考察CHO工程細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)生長和代謝特征。觀察結(jié)果表明，CHO工程細(xì)胞在無血清及有血清懸浮培養(yǎng)條件下表現(xiàn)為大致相似的細(xì)胞生長和代謝特征。在此基礎(chǔ)上，依據(jù)實(shí)際檢測(cè)的數(shù)據(jù)，應(yīng)用MATLAB軟件對(duì)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞生長、乳酸生成及葡萄糖消耗的模型參數(shù)進(jìn)行非線性規(guī)劃，獲得全局性收斂的最優(yōu)參數(shù)估計(jì)值，建立了細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型。

CHO工程細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基，分批培養(yǎng)，代謝動(dòng)力學(xué)

Abstract:By using the cell density, cell viability, Pro-UK activity, specific consumption rate of glucose(qglc), specific production rate of lactate(qlac), yield of lactate to glucose(Ylac/glc)and as the evaluation indexes, the growth and metabolism characteristics of pro-urokinase(Pro-UK)expressing CHO cells in serum-free suspension batch culture were examined and compared to those in serum-containing suspension batch culture.We observed hardly differences in growth and metabolism characteristics between the CHO cell populations grown in serum-free suspension batch culture and serum-containing suspension batch culture.The optimal mathematical model parameters for the CHO cells grown in suspension batch culture were obtained by non-linear programming of data representing the growth, substrate consumption and product formation of the CHO cells during logarithmic growth phase using MATLAB software, and the kinetic model of the cell growth and metabolism in serum-free culture were established.

Keywords:recombinant CHO cells, serum-free medium, batch culture, metabolic dynamics

基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的建模分析是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化 控制的基礎(chǔ)。通過細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型的建立，不僅有助于理解細(xì)胞的代謝和生理特征，也可以為過程控制和優(yōu)化提供理論依據(jù)。在建模分析的過程中，常常需要借助于數(shù)學(xué)工具軟件，在眾多的數(shù)學(xué)工具軟件中，目前MATLAB軟件以其功能強(qiáng)大、使用方便的特點(diǎn)，成為建模分析最常用的數(shù)值處理軟件，近年來 MATLAB也被廣泛地應(yīng)用到微生物發(fā)酵及動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)優(yōu)化控制中[1-2]。本研究以低血清懸浮適應(yīng)的表達(dá)尿激酶原(pro-urokinase，Pro-UK)CHO工程細(xì)胞為研究對(duì)象，以自行設(shè)計(jì)的無血清培養(yǎng)基為培養(yǎng)介質(zhì)，在懸浮分批培養(yǎng)模式下，以細(xì)胞有血清懸浮分批培養(yǎng)作為參照，考察了CHO工程細(xì)胞無血清懸浮分批培養(yǎng)的生長和代謝特征。在此基礎(chǔ)上，為了更準(zhǔn)確地描述細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)條件下的生長及代謝過程，應(yīng)用 MATLAB 軟件，根據(jù)CHO細(xì)胞無血清懸浮分批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分別依據(jù) Logistic方程[3]、Luedeking & Piret方程[4]及質(zhì)量平衡方程對(duì)細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長階段的細(xì)胞生長、乳酸生成及葡萄糖消耗進(jìn)行了模擬，建立了細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的表達(dá)尿激酶原CHO工程細(xì)胞。

1.2 培養(yǎng)基

自行設(shè)計(jì)的無血清培養(yǎng)基：DMEM/F12(1:1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他添加成分主要包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺、微量元素等。

有血清培養(yǎng)基：在DMEM/F12(1:1)中添加1%的小牛血清。

2 方法

2.1 細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)

CHO 細(xì)胞以 3×105～3.5×105cells/mL接種于100 mL搖瓶內(nèi)，培養(yǎng)體積35 mL，培養(yǎng)時(shí)加入含有5 mmol/L 谷氨酰胺、Pluronic F-68(0.1%)及硫酸葡聚糖(25 μg/mL)的無血清或有血清培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速90 r/min，置于37℃溫箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞密度及活率測(cè)定

采用 Cedex AS20細(xì)胞密度和活力自動(dòng)分析系統(tǒng)(Innovatis, Germany)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析。

2.3 培養(yǎng)上清中生化指標(biāo)的測(cè)定

采用 YSI 7100多參數(shù)生物分析系統(tǒng)(Yellow Springs Instruments, USA)定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺的濃度。

2.4 蛋白表達(dá)活性的測(cè)定及計(jì)算

采用體外纖維蛋白瓊脂板溶圈法檢測(cè) Pro-UK體外纖維蛋白溶解活性[5]。

2.5 無血清懸浮批培養(yǎng)的細(xì)胞生長代謝特征

在100 mL的搖瓶中進(jìn)行無血清懸浮批培養(yǎng)，以細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、Pro-UK活性、葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生產(chǎn)速率(qlac)、乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)(Ylac/glc)為考察指標(biāo)，同時(shí)以有血清懸浮批培養(yǎng)作為參照，考察無血清培養(yǎng)條件下CHO細(xì)胞的生長和代謝特征。

2.6 無血清懸浮分批培養(yǎng)的細(xì)胞生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型的建立

依據(jù)細(xì)胞分批培養(yǎng)的細(xì)胞生長、底物消耗及產(chǎn)物形成的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并依?jù) 2.5中無血清分批培養(yǎng)實(shí)際檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用MATLAB軟件進(jìn)行非線性規(guī)劃，采用全局收斂的 Levenberg-Marquardt法，獲得了細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞生長、葡萄糖消耗及乳酸生成的模型參數(shù)最優(yōu)估計(jì)值，建立了細(xì)胞無血清分批培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期的生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型。

2.6.1 細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)

目前常用Monod及Logistic方程來描述細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)。Monod方程是一種理論化的簡單模型[6]，主要用來描述非抑制性單一底物限制情形下的細(xì)胞生長，Logistic方程是一個(gè)典型的S型曲線，能較好地反映細(xì)胞分批培養(yǎng)過程中因細(xì)胞密度的增加對(duì)自身生長的抑制作用，且能較好地反映細(xì)胞分批培養(yǎng)的生長規(guī)律。式(1)中，X為細(xì)胞密度，μmax為最大比生長速率，Xmax為細(xì)胞密度生長上限。

初始條件t=0時(shí)，細(xì)胞密度X等于細(xì)胞初始密度X0。求解式(1)分方程，可得：

2.6.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

細(xì)胞代謝產(chǎn)物生成非常復(fù)雜，定性的描述也很多，產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型中較為通用的模型是由Luedeking & Piret所提出的數(shù)學(xué)表達(dá)式，把產(chǎn)物生成率看作細(xì)胞生長率和細(xì)胞生長量的函數(shù)。

初始條件t=0時(shí)，乳酸濃度P等于接種初始的乳酸濃度P=0。對(duì)(4)式積分可得：

其中，P為乳酸濃度，μmax為最大比生長速率；X0為細(xì)胞初始接種密度；Xmax為細(xì)胞密度生長上限，α和β為常數(shù)。

2.6.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

在細(xì)胞無血清批次懸浮培養(yǎng)的過程中，其消耗主要有 3個(gè)方面：一是細(xì)胞生長的消耗，用以合成新的細(xì)胞；二是細(xì)胞維持基本生命活動(dòng)的消耗；三是用于合成代謝產(chǎn)物的消耗。因此底物消耗動(dòng)力學(xué)模型可表示為：

其中 Yx/s為葡萄糖用于細(xì)胞生長的得率常數(shù)；Yp/s為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；mx為細(xì)胞的維持系數(shù)。將(3)式代入(6)，整理后可得：

初始條件t=0時(shí)，葡萄糖濃度S等于初始葡萄糖濃度S0。求解式(7)積分得：

3 結(jié)果

3.1 CHO工程細(xì)胞無血清分批培養(yǎng)條件下的生長代謝特征

圖1所示細(xì)胞在無血清和有血清培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖呈現(xiàn)大致相似的變化趨勢(shì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞密度逐漸增加，在培養(yǎng)至 96 h細(xì)胞密度達(dá)到最大，分別為3.9×106cells/mL和2.5×106cells/mL，細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長期平均比生長速率分別為0.61 d?1和0.49 d?1，隨后細(xì)胞密度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞密度分別為2.5×106cells/mL和1.4×106cells/mL；兩種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活率沒有明顯差異，細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的細(xì)胞活率總體略好于有血清培養(yǎng)，且在整個(gè)培養(yǎng)過程中細(xì)胞維持較高的活率。兩種培養(yǎng)條件下的Pro-UK活性變化趨勢(shì)也大致相近，Pro-UK最大活性分別為5614 IU/mL 和3513 IU/mL，結(jié)果表明細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的細(xì)胞密度及Pro-UK活性，與有血清培養(yǎng)相比均有了較大程度地提高。

圖2所示為細(xì)胞在無血清和有血清培養(yǎng)條件下細(xì)胞的代謝特征。在無血清及有血清培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)上清葡萄糖濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸降低，呈現(xiàn)出培養(yǎng)前期下降較快、中后期下降減緩的趨勢(shì)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)上清中葡萄糖濃度降至最低，分別為5.03 mmol/L和7.19 mmol/L。兩種培養(yǎng)條件下葡萄糖比消耗速率(qglu)變化趨勢(shì)大體相近，總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，在培養(yǎng)初期 qglu隨著細(xì)胞密度的增加而逐漸增加，培養(yǎng)至72 h qglu達(dá)到最大，分別為 1.81 μmol/(106cells·d)和 2.25 μmol/(106cells·d)，之后隨著細(xì)胞密度的增大，qglu逐漸下降，在培養(yǎng)后期由于細(xì)胞密度的下降及細(xì)胞生理特性的改變，qglu略有升高。兩種培養(yǎng)條件下在對(duì)數(shù)生長期葡萄糖平均比消耗速率分別為 1.33 μmol/(106cells·d)和 1.40 μmol/(106cells·d)，結(jié)果說明兩種培養(yǎng)條件下葡萄糖平均比消耗速率沒有明顯差異。

圖1 細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長(A)及Pro-UK活性(B)Fig.1 Growth(A)and Pro-UK activity(B)of CHO cells in different culture conditions.(A)▲: the specific growth rate of cells cultured in serum-containing medium; △: the specific growth rate of cells cultured in serum-free medium; ■: density of cells cultured in serum-containing medium; □: density of cells cultured in serum-free medium; ◆: viability of cells cultured in serum-containing medium;◇: viability of cells cultured in serum-free medium.(B)■: protein activity of cells cultured in serum-containing medium; ■: protein activity of cells cultured in serum-free medium.Data presented in figure are averages from three experiments, expressed in M±SD.

圖2 細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的生長代謝Fig.2 Metabolism characteristics of CHO cells cultured in different culture conditions.■: the glu concentration and qglu of cells cultured in serum-containing medium; □: the glu concentration and qglu of cells cultured in serum-free medium; ▲: the lac concentration and qlac of cells cultured in serum-containing medium; △: the lac concentration and qlac of cells cultured in serum-free medium; ◆: the gln concentration and qgln of cells cultured in serum-containing medium; ◇: the gln concentration and qgln of cells cultured in serum-free medium.Data presented in figure are averages from three experiments, expressed in M±SD.

在無血清及有血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)初期培養(yǎng)上清中乳酸濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而不斷累積，培養(yǎng)至120 h濃度達(dá)到最大，分別為8.97 mmol/L和6.52 mmol/L，隨后培養(yǎng)上清中乳酸的濃度又呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)上清中乳酸濃度分別降至5.62 mmol/L和4.19 mmol/L；提示在培養(yǎng)后期，由于細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，細(xì)胞同時(shí)消耗葡萄糖及乳酸，用于維持細(xì)胞的活力。兩種培養(yǎng)條件下乳酸比生產(chǎn)速率(qlac)變化總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，兩種培養(yǎng)條件下在對(duì)數(shù)生長期乳酸平均比生產(chǎn)速率分別為1.38 μmol/(106cells·d)和 1.36 μmol/(106cells·d)，且兩種培養(yǎng)條件下在對(duì)數(shù)生長期乳酸對(duì)葡萄糖平均得率系數(shù)(Ylac/glu)分別為 1.06 μmol/μmol、0.97 μmol/μmol。結(jié)果說明兩種培養(yǎng)條件下乳酸平均比生產(chǎn)速率及乳酸對(duì)葡萄糖平均得率系數(shù)沒有明顯差異。在無血清及有血清培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)上清中谷氨酰胺的濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸降低，培養(yǎng)至 72 h時(shí)，培養(yǎng)上清中谷氨酰胺分別降為0.39 mmol/L和0.56 mmol/L；兩種培養(yǎng)條件下谷氨酰胺比消耗速率(qgln)變化總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，兩種培養(yǎng)條件下谷氨酰胺平均比消耗速率分別為 1.06 μmol/(106cells·d)和 1.12 μmol/(106cells·d)，說明兩種培養(yǎng)條件下 qgln沒有明顯差異。

3.2 細(xì)胞無血清分批培養(yǎng)生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型的建立

在動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)研究中，所用的動(dòng)力學(xué)模型多為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并且大多?shù)只能分段描述，對(duì)于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的生長及代謝過程可以較好地模擬，但都不能很好地模擬細(xì)胞生長的整個(gè)過程。在細(xì)胞無血清分批培養(yǎng)生長及代謝動(dòng)力學(xué)研究中，根據(jù)CHO細(xì)胞無血清懸浮分批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分別依據(jù)Logistic方程、Luedeking & Piret方程及質(zhì)量平衡方程對(duì)細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長階段的細(xì)胞生長、乳酸生成及葡萄糖消耗進(jìn)行了模擬。將式(2)、(5)、(8)自定義為擬合函數(shù)，根據(jù)實(shí)際測(cè)得的細(xì)胞無血清及有血清分批培養(yǎng)中所測(cè)得的細(xì)胞密度、乳酸生成及葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并運(yùn)用MATLAB軟件中的曲線擬合工具箱對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，可分別求得各個(gè)參數(shù)，結(jié)果見表 1。細(xì)胞在兩種培養(yǎng)條件下在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞生長、乳酸生成及葡萄糖消耗的實(shí)驗(yàn)值與模型擬合圖見圖3～5。

從圖3可以看出在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期，模擬計(jì)算的細(xì)胞密度變化曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合較好，置信度選為0.95。模型經(jīng)F檢驗(yàn)后顯著性很高，無血清及有血清培養(yǎng)條件下的R2分別為0.979和0.985，即在無血清及有血清培養(yǎng)條件下模型分別在 97.9%及98.5%的概率水平上非常顯著。說明這一模型較好地描述了兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長的實(shí)際過程。

表1 細(xì)胞無血清及有血清懸浮分批培養(yǎng)各參數(shù)比較Table 1 Kinetics model parameter of the CHO cells in serum-free and serum-containing suspension batch culture

圖3 無血清(A)及有血清(B)懸浮分批培養(yǎng)細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)值與模型擬合值的比較Fig.3 Fitting curve of the cells growth in serum-free and serum-containing suspension batch culture.(A)Serum-free.(B)Serum-containing.

圖4 無血清(A)及有血清(B)懸浮分批培養(yǎng)乳酸生成實(shí)驗(yàn)值與模型擬合值的比較Fig.4 Fitting curve of the lactate accumulation of cells in serum-free and serum-containing suspension batch culture.(A)Serum-free.(B)Serum-containing.

圖5 無血清(A)及有血清(B)懸浮分批培養(yǎng)葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)值與模型擬合值的比較Fig.5 Fitting curve of the glucose consumption of cells in serum-free and serum-containing suspension batch Culture.(A)Serum-free.(B)Serum-containing.

從圖4可以看出，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長階段，模擬計(jì)算的乳酸生成變化曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況比較理想，置信度選為0.95。模型經(jīng)F檢驗(yàn)后顯著性很高，無血清及有血清培養(yǎng)條件下的 R2分別為 0.971和0.983，即在無血清及有血清培養(yǎng)條件下模型分別在 97.1%及 98.3%的概率水平上非常顯著。說明建立的產(chǎn)物生成模型可用于描述兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞懸浮分批培養(yǎng)乳酸的生成。

從圖5可以看出在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長階段，模擬計(jì)算的葡萄糖消耗變化曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況比較理想。模型經(jīng)F檢驗(yàn)后顯著性很高，無血清及有血清培養(yǎng)條件下的R2分別為0.963和0.961，即在無血清及有血清培養(yǎng)條件下模型分別在 96.3%及96.1%的概率水平上非常顯著。說明該方程在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長階段能很好地描述兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞懸浮分批培養(yǎng)葡萄糖消耗隨時(shí)間變化的關(guān)系。

綜上所述，細(xì)胞在無血清批次培養(yǎng)條件下的對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞生長、乳酸生成及葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型方程如下：

4 討論

通常情況下，當(dāng)細(xì)胞從有血清的狀態(tài)下進(jìn)入無血清環(huán)境時(shí)，由于存在代謝轉(zhuǎn)換，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長滯遲的現(xiàn)象，因此細(xì)胞常常需要在無血清培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)[7-8]。在本研究中，當(dāng)CHO工程細(xì)胞從有血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)胞并沒有出現(xiàn)常見的細(xì)胞生長滯遲的現(xiàn)象，對(duì)比有血清及無血清條件下細(xì)胞培養(yǎng)初期的比生長速率(圖1)，在培養(yǎng)至24 h時(shí)，兩種培養(yǎng)條件下比生長速率分別為0.56 d?1和0.58 d?1，培養(yǎng)至48 h時(shí)兩種培養(yǎng)條件下比生長速率達(dá)到最大，分別為0.61 d?1和0.80 d?1，說明在進(jìn)行CHO工程細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷了低血清的懸浮適應(yīng)后，細(xì)胞無須再進(jìn)行無血清懸浮適應(yīng)，就可以較快地生長。但從圖2可以看出，在無血清培養(yǎng)條件下，細(xì)胞在培養(yǎng)初始的葡萄糖比消耗速率、谷氨酰胺比消耗速率及乳酸比生產(chǎn)速率明顯高于有血清培養(yǎng)條件，之后細(xì)胞的葡萄糖比消耗速率及乳酸比生產(chǎn)速率總體上低于有血清，結(jié)果提示當(dāng)細(xì)胞從有血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基后，細(xì)胞可能需要一個(gè)較為短暫的適應(yīng)過程，因此在培養(yǎng)初始增加了能耗，產(chǎn)生了較多的乳酸。

一些研究表明，雜交瘤細(xì)胞系葡萄糖代謝過程中，乳酸的生成存在著切換作用，最近通過對(duì)這種代謝切換的分子機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖濃度從高變低時(shí)會(huì)引起代謝的變換，切換的結(jié)果是乳酸的產(chǎn)率下降，有時(shí)會(huì)降到零[9-10]。圖2所示在細(xì)胞培養(yǎng)的平臺(tái)期及衰退期由于細(xì)胞密度及培養(yǎng)上清中葡萄糖濃度的逐步下降，細(xì)胞的葡萄糖的消耗基本維持在一個(gè)較低的水平，同時(shí)乳酸也不再產(chǎn)出，培養(yǎng)上清中乳酸累積量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。結(jié)果提示細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)的后期，可能是由于細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，細(xì)胞的代謝途徑發(fā)生了變化，細(xì)胞同時(shí)消耗葡萄糖及乳酸，用于維持細(xì)胞的活力?？傮w而言，依據(jù)細(xì)胞在兩種培養(yǎng)條件下對(duì)數(shù)生長期的葡萄糖平均比消耗速率及乳酸平均比生產(chǎn)速率，表明細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下對(duì)葡萄糖具有更高的利用效能，不僅有效地支持了細(xì)胞的生長及蛋白的表達(dá)，也提高了細(xì)胞對(duì)萄糖的利用效率。

細(xì)胞培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)模型可以分為非結(jié)構(gòu)模型和結(jié)構(gòu)模型兩大類結(jié)構(gòu)模型，非結(jié)構(gòu)模型是一種經(jīng)驗(yàn)性模型，來自對(duì)生物過程基本現(xiàn)象的觀察，可用于描述細(xì)胞培養(yǎng)中很多重要的特性，在生物過程的控制和優(yōu)化中經(jīng)常用到[11-12]；結(jié)構(gòu)模型是基于細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，主要包括化學(xué)計(jì)量平衡模型、代謝流模型及控制論模型等，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，用化學(xué)計(jì)量平衡和代謝流分析的方法研究代謝路徑已經(jīng)開展了多年，并取得了不少成果[13-14]。然而由于動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)非常復(fù)雜，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)生物過程的數(shù)學(xué)描述只能是近似的，因此在對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的研究中，多使用非結(jié)構(gòu)模型。在建立細(xì)胞生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型時(shí)，需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和細(xì)胞生長代謝特性，并經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，不斷修正參數(shù)，從而使模型能更好地反映細(xì)胞生長代謝的內(nèi)在規(guī)律。在求解參數(shù)時(shí)，常需借助各類計(jì)算機(jī)軟件如SAS、Origin及SPSS等軟件，對(duì)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)進(jìn)行非線性擬合，并以絕對(duì)誤差平方和最小為目標(biāo)，多采用Runge-Kutta法、Marquardt法及遺傳算法等方法求解參數(shù)。近年來隨著MATLAB軟件功能的日益完善及各類工具箱的開發(fā)，MATLAB軟件的應(yīng)用幾乎覆蓋了各行各業(yè)。MATLAB軟件也被逐漸應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的生長及代謝動(dòng)力學(xué)模型的建立。

本研究應(yīng)用MATLAB軟件的擬合工具箱，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)獲得模型參數(shù)的初估值，采用經(jīng)Levenberg-Marquardt修正的高斯-牛頓法，以全局性收斂為目標(biāo)，不斷修正模型參數(shù)的初估值，獲得最優(yōu)估計(jì)參數(shù)。結(jié)果表明細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞生長、乳酸生成及葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型方程基本反映了細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞生長、基質(zhì)葡萄糖消耗及乳酸產(chǎn)出的內(nèi)在規(guī)律。雖然Logistic方程只涉及到了最大比生長速率，未能對(duì)整個(gè)培養(yǎng)過程中的比生長速率的變化規(guī)律進(jìn)行詳盡的描述，但是也比較本質(zhì)地反映了細(xì)胞生長的快慢。通過產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型確定的乳酸與細(xì)胞耦聯(lián)參數(shù)α和非耦聯(lián)參數(shù)β，較清晰地反映了細(xì)胞生長與乳酸產(chǎn)出的關(guān)系。底物消耗動(dòng)力學(xué)模型所確定的碳源用于細(xì)胞生長的得率常數(shù)Yx/s和碳源用于乳酸生成的得率常數(shù)Yp/s與細(xì)胞在無血清及有血清條件下生長的實(shí)際狀況基本吻合，也進(jìn)一步印證了細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下對(duì)葡萄糖具有更高的利用效能。

REFERENCES

[1]Sauer PW, Burky JE, Wesson MC.A high-yielding generic fed-batch cell culture process for production of recombinant antibodies.Biotechnol Bioeng, 2000, 67(5): 585?597.

[2]Senger RS, Karim MN.Optimization of fed-batch parameters and harvest time of CHO cell cultures for a glycosylated productwith multiple mechanisms of inactivation.Biotechnol Bioeng, 2007, 98(2): 378?390.

[3]Bailey JE, Ollis DF.Biochemical Engineering Fundamentals.2nd Ed.New York: Mc-Grawl-Hill Book Company, 1986.

[4]Luedeking R, Piret EL.A kinetic study of the lactic acid fermentation: batch process at controlled pH.J Biochem Microbiol Technol Eng, 2004, 1(4): 393?412.

[5]Han SW, Yu WY, Li XZ, et al.Study on plasminogen activators secreted by various cultured cells.Bull Acad Mil Med Sci, 1987, 11: 101?108.韓素文, 俞煒源, 李秀珍, 等.培養(yǎng)細(xì)胞分泌的血纖維蛋白溶解酶原激活物的研究.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,1987, 11: 101?108.

[6]Monod J.The growth of bacterial cultures.Annu Rev Microbiol, 1949, 3: 364?371.

[7]Kurano N, Leist C, Messi F, et al.Growth behavior of Chinese haster ovary cells in a compact loop bioreactor: 1.Effects of physical and chemical enviroments.J Biotechnol, 1990, 15(1): 101?112.

[8]Ozturk SS, Palsson BO.Physiological changes during the adaption of hybridoma cells to low serum and serum-free media.Biotechnol Bioeng, 1991, 37(1): 35?46.

[9]Europa AF, Gambhir A, Fu PC, et al.Multiple steady states with distinct cellular metabolism in continuous culture of mammalian cells.Biotechnol Bioeng, 2000,67(1): 25?34.

[10]Korke R, Gatti Mde L, Lau AL, et al.Large scale gene expression profiling of metabolic shift of mammalian cells in culture.J Biotechnol, 2004, 107(1): 1?17.

[11]Zeng AP, Bi J.Cell culture kinetics and modeling//Ozturk SS, Hu WS.Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cellular Therapies.Atlanta: Taylor & Francis Group,2003: 299?347.

[12]Goudar CT, Joeris K, Konstantinov KB, et al.Logistic equations effectively model mammalian cell batch and fed-batch kinetics by logically constraining the fit.Biotechnol Prog, 2005, 21(4): 1109?1118.

[13]Provost A, Bastin G.Dynamic metabolic modeling under the balanced growth condition.J Proc Cont, 2004, 14(7):717?728.

[14]Novák B, Tyson JJ.A model for restriction point control of the mammalian cell cycle.J Theor Biol, 2004, 230(4):563?579.

Metabolic characteristics and kinetic model of recombinant CHO cells in serum-free suspension batch culture

Xingmao Liu, Hong Liu, Lingling Ye, Shichong Li, Benchuan Wu, Haitao Wang, Jing Xie, and Zhaolie Chen
Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received:August 6, 2009;Accepted:November 9, 2009

Supported by:National Major Special Program of New Drug Research and Development(No.2009ZX09503-011).

Corresponding author:Zhaolie Chen.E-mail: chenzl23@hotmail.com重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(No.2009ZX09503-011)資助。