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        廢糟液全循環(huán)對(duì)自絮凝酵母糖酵解途徑關(guān)鍵酶、脅迫相關(guān)代謝物及胞內(nèi)組分的影響

        2010-10-16 08:09:04孜力汗張春明任劍剛袁文杰陳麗杰
        生物工程學(xué)報(bào) 2010年7期

        孜力汗,張春明,任劍剛,袁文杰,陳麗杰

        大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,大連 116023

        廢糟液全循環(huán)對(duì)自絮凝酵母糖酵解途徑關(guān)鍵酶、脅迫相關(guān)代謝物及胞內(nèi)組分的影響

        孜力汗,張春明,任劍剛,袁文杰,陳麗杰

        大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,大連 116023

        旨在研究廢糟液直接全循環(huán)對(duì)絮凝酵母乙醇發(fā)酵、糖酵解關(guān)鍵酶以及細(xì)胞組成的影響。在一有效容積1.5 L的攪拌式生物反應(yīng)器中,使用葡萄糖為220 g/L,添加8 g/L酵母粉和6 g/L蛋白胨的培養(yǎng)基,以0.04 h?1的稀釋率進(jìn)行自絮凝顆粒酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵。每隔 3天將收集到的發(fā)酵液集中精餾處理,得到的廢糟液用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。裝置運(yùn)行近20 d,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著廢液循環(huán)批次的增加,系統(tǒng)乙醇和生物量濃度明顯降低,糖酵解途徑3個(gè)關(guān)鍵限速酶:己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶不同程度受到抑制。為了應(yīng)對(duì)廢糟液中高沸點(diǎn)副產(chǎn)物積累導(dǎo)致的環(huán)境脅迫,維持細(xì)胞正常代謝,甘油和菌體胞內(nèi)蛋白生物合成加強(qiáng),碳水化合物積累減弱。這些研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究高沸點(diǎn)副產(chǎn)物積累對(duì)酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵影響的機(jī)理和菌種的代謝工程改造,具有重要意義。

        乙醇發(fā)酵,自絮凝酵母,廢糟液循環(huán),高沸點(diǎn)副產(chǎn)物

        Abstract:This research aimed to study the effect of distillage recycling on ethanol fermentation, the key glycolytic enzymes and cell composition of the self-flocculating yeast.With the self-flocculating yeast SPSC01 and medium composed of 220 g/L glucose, 8 g/L yeast extract and 6 g/L peptone, continuous ethanol fermentation was carried out at the dilution rate of 0.04 h?1with a 1.5 L tank bioreactor.Fermentation broth was collected every 3 days, and ethanol and other volatile byproducts were removed by distillation, but the stillage with high boiling byproducts was recycled to prepare the medium instead of fresh water.The system was run for 20 days, during which ethanol and biomass concentrations in the effluent decreased continuously, indicating the significant inhibition of the high boiling byproducts accumulated within the system.Thus, the activities of the key enzymes of the glycolytic pathway: hexokinase, 6-phosphofructose kinase, and pyruvate kinase were analyzed, and it was observed that all of them were inhibited.Furthermore, the biosynthesis of the stress response metabolites glycerol and trehalose was investigated, and it was found that glycerol production that can protect yeast cells against osmotic pressure stress was enhanced, but trehalose biosynthesis that can protect yeast cells against ethanol inhibition was not improved, correspondingly.And in the meantime, the biosynthesis of the major intracellular components proteins and hydrocarbons was adjusted, correspondingly.

        Keywords:ethanol fermentation, self-flocculating yeast, recycling of distillage, high boiling byproducts

        基于生物質(zhì)資源生產(chǎn)的燃料乙醇可與成品油以一定比例配混或直接使用,不僅可以替代等量成品油,對(duì)緩解由于石油資源短缺導(dǎo)致的液體燃料供應(yīng)緊張具有重要意義[1]。這種混合燃料或純乙醇可以減少發(fā)動(dòng)機(jī)尾氣溫室氣體的凈排量,有助于溫室氣體減排[2]。國內(nèi)外燃料乙醇主要以糖質(zhì)原料和淀粉質(zhì)原料生產(chǎn),在現(xiàn)有技術(shù)水平下,乙醇發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度一般可以達(dá)到12%(V/V)左右,因此1 t乙醇生產(chǎn)可產(chǎn)生10 t左右廢糟液[3]。

        以玉米和小麥等糧食類淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇產(chǎn)生的廢糟液富含蛋白,適宜于作為動(dòng)物飼料。在工業(yè)生產(chǎn)中,廢糟液經(jīng)離心機(jī)分離得到的上清液約30%直接循環(huán)使用,其余部分連同得到固形物,采用全蒸發(fā)濃縮技術(shù)(Distillers dried grains with solubles,DDGS)生產(chǎn)蛋白飼料[4]。雖然 DDGS技術(shù)廢糟液處理比較徹底,但設(shè)備投資和運(yùn)行能耗都很高,提高乙醇發(fā)酵系統(tǒng)廢糟液循環(huán)使用的比例,對(duì)降低DDGS系統(tǒng)的設(shè)備投資、節(jié)省運(yùn)行能耗具有十分重要的意義。

        基于自絮凝顆粒酵母的乙醇發(fā)酵技術(shù),通過原料前處理綜合利用及發(fā)酵后酵母從發(fā)酵液中自沉降分離進(jìn)行深加工,可以使精餾系統(tǒng)產(chǎn)生的廢糟液COD濃度顯著降低,為其大比例乃至全循環(huán)使用創(chuàng)造了良好條件[5]。然而,在廢糟糟液全循環(huán)使用過程中,酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵和發(fā)酵液精餾等生產(chǎn)環(huán)節(jié)產(chǎn)生的高沸點(diǎn)副產(chǎn)物必然在發(fā)酵系統(tǒng)中發(fā)生積累,對(duì)酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵產(chǎn)生一定的影響。本文在前期四級(jí)串聯(lián)懸浮床生物反應(yīng)器系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自絮凝顆粒酵母乙醇發(fā)酵耦合廢糟液全循環(huán)的基礎(chǔ)上[6],建立一套單級(jí)連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng),以葡萄糖為發(fā)酵底物,在廢糟液全循環(huán)條件下使高沸點(diǎn)副產(chǎn)物快速積累,進(jìn)一步考察對(duì)自絮凝顆粒酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵過程、糖酵解途徑關(guān)鍵酶、酵母細(xì)胞環(huán)境脅迫應(yīng)激反應(yīng)代謝產(chǎn)物及胞內(nèi)生物質(zhì)組成的影響。

        1 材料與方法

        1.1 菌種

        自絮凝顆粒酵母(SPSC01)是粟酒裂殖酵母Schizosaccharaomyces pombe和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae通過原生質(zhì)體融合而得到的融合株。該菌株具有兩親株的優(yōu)點(diǎn),乙醇發(fā)酵性能優(yōu)良且具有良好自絮凝特性,由大連理工大學(xué)生物工程系保藏[7]。

        1.2 培養(yǎng)基及方法

        斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母粉4,蛋白胨3,瓊脂15,4℃保存。

        種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30,酵母粉4,蛋白胨3,121℃滅菌15 min。

        擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 100,酵母粉4,蛋白胨3,121℃滅菌15 min。

        發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 220,酵母粉8,蛋白胨6,115℃滅菌15 min。

        1.2.1 搖瓶種子初級(jí)培養(yǎng)

        從活化斜面種子上取一環(huán)酵母種子接入含有100 mL種子培養(yǎng)基250 mL錐形瓶中,于30℃、150 r/min條件下恒溫培養(yǎng)24 h。

        1.2.2 發(fā)酵罐種子擴(kuò)大培養(yǎng)

        搖瓶種子靜置后棄去上清液,將酵母接入裝有0.5 L擴(kuò)大培養(yǎng)基、工作容積1.5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行間歇擴(kuò)大培養(yǎng),其培養(yǎng)條件為:溫度30℃,pH 4.5,攪拌速率150 r/min,通氣量0.5 vvm。待發(fā)酵液殘?zhí)菨舛冉档椭? g/L以下時(shí),切換為流加培養(yǎng)基,控制流加速率使殘?zhí)菨舛染S持在1 g/L以下,待酵母細(xì)胞濃度接近30 g/L時(shí),擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束。

        1.2.3 乙醇連續(xù)發(fā)酵

        停止攪拌和通氣,使絮凝酵母自行沉降,然后用泵抽出上清液,恢復(fù)攪拌和通氣,隨即快速流加發(fā)酵培養(yǎng)基1.5 L至發(fā)酵罐溢流口,使系統(tǒng)進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài),待發(fā)酵液殘?zhí)菨舛冉档椭? g/L以下時(shí),開始流加發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇連續(xù)發(fā)酵。乙醇連續(xù)發(fā)酵的操作條件為:稀釋速率0.04 h?1,溫度30℃,pH值4.2~4.5,攪拌速率150 r/min,通氣量0.05 vvm,實(shí)驗(yàn)裝置的工藝流程如圖1所示。

        在絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中每隔3天將收集到的發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾,得到的廢糟液用于配制新鮮培養(yǎng)基,作為廢糟液循環(huán)的一個(gè)批次,對(duì)應(yīng)的時(shí)間間隔為72 h。

        圖1 廢糟液全循環(huán)絮凝酵母SPSC01乙醇連續(xù)發(fā)酵工藝過程流程圖Fig.1 Flow chart of continuous ethanol fermentation coupled with waste distillage using self-flocculating yeast SPSC01.

        1.3 分析方法

        1.3.1 生物量的測(cè)定

        生物量的測(cè)定是以單位體積發(fā)酵液中菌體干重[g(d.w.)/L]表示,每次取4 mL發(fā)酵液離心后用蒸餾水重復(fù)洗滌3次,置于85℃烘箱中烘干24 h至恒重,取出后置于干燥器中冷卻至室溫后稱重。

        1.3.2 胞外代謝物分析

        乙醇和葡萄糖濃度用SBA-50B生物傳感分析儀(山東省生物科學(xué)研究所)分析[11]。發(fā)酵液甘油濃度利用Waters600高效液相色譜測(cè)定,色譜分離條件:離子排斥柱(Bio-Rad Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm),流動(dòng)相選用0.005 mol/L的H2SO4,流速為0.4 mL/min,色譜柱溫度為55℃,采用Waters410示差折光檢測(cè)器,溫度為 50℃,并用 Waters Millennium32軟件處理數(shù)據(jù)。

        1.3.3 細(xì)胞組分分析

        胞內(nèi)海藻糖的提取參照文獻(xiàn)[8]。胞內(nèi)總糖用苯酚法測(cè)定[9],胞內(nèi)總蛋白用二縮脲法測(cè)定[10]。

        1.3.4 細(xì)胞酶活測(cè)定

        己糖激酶、丙酮酸激酶和果糖-6-磷酸激酶的測(cè)定分別參考文獻(xiàn)[11]、[12]和[13]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 廢液全循環(huán)條件下自絮凝酵母SPSC01乙醇連續(xù)發(fā)酵過程各參數(shù)的變化

        圖2所示為廢液全循環(huán)條件下自絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵過程發(fā)酵液中乙醇、殘?zhí)且约吧锪繚舛鹊淖兓闆r,裝置連續(xù)運(yùn)行近400 h,5個(gè)廢糟液循環(huán)批次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,裝置運(yùn)行約80 h后,發(fā)酵液中乙醇濃度逐漸降低,殘?zhí)菨舛认鄳?yīng)增高,生物量濃度也不斷下降,說明廢糟液中副產(chǎn)物積累對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵產(chǎn)生了明顯影響。

        圖2 廢液全循環(huán)條件下自絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵過程乙醇、殘?zhí)且约吧锪康淖兓疐ig.2 Time courses of ethanol, residual glucose and biomass of the continuous ethanol fermentation with the self-flocculating yeast and coupled with waste distillage recycling.P: ethanol; S: residual glucose; X: biomass.

        廢糟液中的副產(chǎn)物來源有 2個(gè)方面:一是酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵過程產(chǎn)生的高沸點(diǎn)副產(chǎn)物,如有機(jī)酸和甘油等[14];二是發(fā)酵液成分比較復(fù)雜,在蒸餾過程高溫作用下某些組分間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生一些對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生抑制效應(yīng)的物質(zhì),如殘?zhí)桥c氨基酸之間發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)生成的產(chǎn)物[15]。

        2.2 糖酵解途徑關(guān)鍵酶活變化

        高沸點(diǎn)副產(chǎn)物積累對(duì)自絮凝顆粒酵母乙醇發(fā)酵性能的影響必然體現(xiàn)到糖酵解途徑關(guān)鍵酶的活性上,圖3所示為己糖激酶(Hexokinase,HK)、6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructose kinase,PFK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)活性的變化。

        圖3 廢糟液循環(huán)對(duì)自絮凝顆粒酵母胞內(nèi)己糖激酶(A)、6-磷酸果糖激酶(B)和丙酮酸激酶(C)活性的影響Fig.3 Impact of distillage recycling on enzymatic activities of hexokinase(HK, A), 6-phosphofructose kinase(PFK, B)and pyruvatekinase(PK, C)of the self-flocculating yeast.

        可見隨廢糟液循環(huán)批次的增加,這3個(gè)激酶的酶活都有不同程度的降低。其中PFK在前3次廢液循環(huán)過程中略微增加,隨后迅速下降,到第6次循環(huán)結(jié)束時(shí)酶活由初始的 535.4 U/(g蛋白)降低至122.9 U/(g蛋白);PK酶活在第1次廢液循環(huán)后迅速下降至最低值7.8 U/(g蛋白),到第3次循環(huán)時(shí)酶活略微增加,隨后的4個(gè)循環(huán)批次酶活基本穩(wěn)定在15 U/(g蛋白)左右;而HK酶活在前4次廢液循環(huán)過程中基本穩(wěn)定,第 5次循環(huán)開始酶活迅速下降,到第6次循環(huán)時(shí)酶活由初始的1 575.4 U/(g蛋白)降低至656.8 U/(g蛋白)。在乙醇發(fā)酵的pH條件下,廢糟液循環(huán)時(shí)高沸點(diǎn)副產(chǎn)物尤其是有機(jī)酸多以分子狀態(tài)存在,這樣可以自由進(jìn)入細(xì)胞,致使細(xì)胞質(zhì)酸化[16]。研究發(fā)現(xiàn),pH值對(duì)己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶酶活影響顯著,與胞內(nèi)pH 7.2時(shí)活性相比,當(dāng)胞內(nèi)pH為6.8或當(dāng)發(fā)酵液pH 6.6乙酸濃度大于1 000 mmol/L時(shí),己糖激酶酶活降低了50%;而pH為6.3或當(dāng)發(fā)酵液pH 6.6乙酸濃度為279 mmol/L時(shí),6-磷酸果糖激酶酶活降低了50%;胞內(nèi) pH小于 6.0或當(dāng)發(fā)酵液 pH 6.6乙酸濃度為409 mmol/L時(shí),丙酮酸激酶酶活降低了50%[17]。同時(shí),當(dāng)呋喃類化合物的濃度較高時(shí)顯著抑制己糖激酶活性[18]。

        2.3 酵母胞內(nèi)海藻糖與胞外甘油濃度的變化

        乙醇發(fā)酵過程中,甘油是產(chǎn)量最大的副產(chǎn)物,其主要作用是維持酵母細(xì)胞氧化還原平衡[19]。同時(shí),甘油對(duì)酵母細(xì)胞具有一定的滲透壓保護(hù)作用[20]。甘油-3-磷酸(G3P)經(jīng)NAD依賴的甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)脫磷酸后生成甘油,在釀酒酵母里GPD1和GPD2編碼甘油-3-磷酸脫氫酶異構(gòu)酶,研究表明GPD1的表達(dá)受滲透壓調(diào)節(jié),GPD2的表達(dá)不受外部滲透壓影響,但在缺氧的條件下被啟動(dòng)通過提供還原力維持細(xì)胞的氧化還原平衡[21]。海藻糖是酵母細(xì)胞在脅迫條件下胞內(nèi)合成的一種保護(hù)性多糖,海藻糖在胞內(nèi)的含量可以直接反映細(xì)胞環(huán)境脅迫反應(yīng)應(yīng)激的程度[22-24]。因此,高沸點(diǎn)副產(chǎn)物積累對(duì)自絮凝顆粒酵母生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵性能的影響應(yīng)該在甘油和海藻糖代謝上得以體現(xiàn)(圖4)。

        可見甘油在第一個(gè)循環(huán)批次生成量稍有下降,到第二個(gè)循環(huán)批次生成量迅速增加,表明開始時(shí)甘油量隨乙醇濃度的下降而略微降低,發(fā)酵液中副產(chǎn)物積累導(dǎo)致的滲透壓還不足以對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生明顯影響,但隨副產(chǎn)物的不斷積累,發(fā)酵液滲透壓增加,酵母細(xì)胞增加了甘油合成,以抵抗?jié)B透壓脅迫[25]。因此,廢液循環(huán)初期,甘油主要給細(xì)胞提供還原力維持細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵,而從第二個(gè)循環(huán)批次開始,甘油生成對(duì)酵母細(xì)胞滲透壓脅迫提供保護(hù)。胞內(nèi)海藻糖積累隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯下降的趨勢(shì),與圖2所示的發(fā)酵液中乙醇濃度變化基本一致,表明胞內(nèi)海藻糖積累受乙醇脅迫的影響更顯著。

        圖4 自絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵耦合廢糟液全循環(huán)條件下甘油生成(A)和胞內(nèi)海藻糖積累(B)Fig.4 Glycerol production(A)and intracellular trehalose accumulation(B)of the self-flocculating yeast during continuous ethanol fermentation coupled with distillage recycling.

        2.4 酵母細(xì)胞組分的變化

        對(duì)糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性和酵母細(xì)胞環(huán)境脅迫應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物甘油和海藻糖的分析,能夠在一定程度上揭示廢糟液循環(huán)使用導(dǎo)致高沸點(diǎn)副產(chǎn)物積累對(duì)自絮凝顆粒酵母乙醇發(fā)酵的影響。但隨發(fā)酵廢液循環(huán)批次的增加,生物量濃度逐漸降低,說明對(duì)酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響,進(jìn)一步分析胞內(nèi)生理大分子的變化可以反映出對(duì)酵母基礎(chǔ)代謝的影響。圖5所示為胞內(nèi)總蛋白和總糖的變化情況。

        可見隨著廢液循環(huán)批次的增加,胞內(nèi)總蛋白從36.01%增加到 59.6%,而總碳水化合物從 45.01%降低至 29.3%,表明副產(chǎn)物積累促進(jìn)了胞內(nèi)蛋白的合成,但減緩了碳水化合物的積累。胞內(nèi)總蛋白合成的增加,可以提供更多的酶來彌補(bǔ)酶活性的降低,而碳水化合物合成的減少,可以節(jié)省能量消耗。

        圖5 自絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵耦合廢糟液全循環(huán)條件下胞內(nèi)蛋白(A)和碳水化合物(B)的合成Fig.5 Intracellular protein(A)and carbohydrates(B)biosynthesis of the self-flocculating yeast during continuous ethanol fermentation coupled with distillage recycling.

        3 結(jié)論與展望

        對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)中使用的粗原料,不論是采用前處理綜合利用的清液發(fā)酵技術(shù),還是從廢糟液中分離固體糟渣的帶渣發(fā)酵技術(shù),部分廢糟液將隨濕渣離開系統(tǒng)。因此,即使廢糟液全循環(huán)使用,從物料平衡的角度看,也不會(huì)導(dǎo)致高沸點(diǎn)副產(chǎn)物在系統(tǒng)中無限積累,只要這些副產(chǎn)物的平衡濃度低于對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制效應(yīng)的臨界濃度,就不會(huì)對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯影響。在抑制現(xiàn)象發(fā)生時(shí),酵母細(xì)胞糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性受到影響,同時(shí)與環(huán)境脅迫反應(yīng)相關(guān)的途徑也發(fā)生了相應(yīng)的調(diào)節(jié),如甘油代謝及胞內(nèi)主要組分如蛋白和碳水化合物的生物合成等,這些調(diào)節(jié)作用的機(jī)理還有待于在鑒明這些環(huán)境脅迫因素的基礎(chǔ)上,從代謝和相關(guān)酶基因表達(dá)水平上進(jìn)行深入研究。

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        Impact of distillage recycling on the glycolysis key enzymes,stress response metabolites and intracelluler components of the self-flocculating yeast

        Lihan Zi, Chunming Zhang, Jiangang Ren, Wenjie Yuan, and Lijie Chen
        School of Bioscience and Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116023, China

        Received:May 17, 2010;Accepted:June 11, 2010

        Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA10Z358).

        Corresponding author:Lihan Zi.Tel/Fax: +86-411-84706308; E-mail: lihanzi@dlut.edu.cn國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2007AA10Z358)資助。

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