林貝，趙心清，張秋美，馬黎明，白鳳武

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024 2 北京化工大學(xué)北方學(xué)院理工院，廊坊 065201

絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1啟動子區(qū)的克隆和乙醇脅迫下啟動子活性的變化

林貝1,2，趙心清1，張秋美1，馬黎明1，白鳳武1

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024 2 北京化工大學(xué)北方學(xué)院理工院，廊坊 065201

提高生物能源生產(chǎn)菌株對各種脅迫因素的耐受性對于提高生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性和高效生產(chǎn)生物能源具有重要的意義。對釀酒酵母乙醇耐性的分子機(jī)制的研究，可揭示影響其耐受性的關(guān)鍵基因，并通過代謝工程操作定向提高酵母菌的乙醇耐受性，從而提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率。海藻糖對酵母菌在多種環(huán)境脅迫下的細(xì)胞活性具有保護(hù)作用，但其對乙醇耐性分子機(jī)制的研究還不夠深入?？寺×俗孕跄湍窼accharomyces cerevisiaeflo的海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1的啟動子區(qū)域，利用pYES2.0載體骨架，構(gòu)建了PTPS1啟動綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記基因的報(bào)告載體，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母ATCC4126。對酵母轉(zhuǎn)化子在含有7%和10%乙醇的生長培養(yǎng)基中的EGFP的表達(dá)情況進(jìn)行相對熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)PTPS1活性在7%乙醇存在下受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)。EGFP表達(dá)量對高溫和高糖脅迫無明顯差別，顯示了TPS1啟動子對乙醇濃度的特異響應(yīng)。研究結(jié)果表明，絮凝酵母海藻糖的合成是對乙醇脅迫的保護(hù)性反應(yīng)。

自絮凝酵母，海藻糖-6-磷酸合成酶TPS1，綠色熒光蛋白，報(bào)告載體，乙醇脅迫

Abstract:Improving stress tolerance of the microbial producers is of great importance for the process economy and efficiency of bioenergy production.Key genes influencing ethanol tolerance of brewing yeast can be revealed by studies on the molecular mechanisms which can lead to the further metabolic engineering manipulations for the improvement of ethanol tolerance and ethanol productivity.Trahalose shows protective effect on the cell viability of yeast against multiple environmental stress factors, however,further research is needed for the exploration of the underlying molecular mechanisms.In this study, the promoter region of the trehalose-6-phosphate synthase geneTPS1was cloned from the self-flocculating yeastSaccharomyces cerevisiae flo,and a reporterplasmid based on the expression vector pYES2.0 on which the green fluorescence protein EGFP was directed by theTPS1promoter was constructed and transformed to industrial yeast strainSaccharomyces cerevisiaeATCC4126.Analysis of the EGFP expression of the yeast transformants in presence of 7% and 10% ethanol revealed that thePTPS1activity was strongly induced by 7% ethanol,showing specific response to ethanol stress.The results of this study indicate that trehalose biosynthesis in self-flocculating yeast is a protective response against ethanol stress.

Keywords:self-flocculating yeast, trehalose-6-phosphate synthase, green fluorescence protein, report vector, ethanol stress

提高生物能源生產(chǎn)菌株對各種脅迫因素的耐受性對于高效生產(chǎn)生物能源具有重要的意義，這些脅迫因素包括高溫、高滲透壓、低pH以及各種毒性代謝物或原料水解產(chǎn)物等。對于利用釀酒酵母生產(chǎn)燃料乙醇，尤其是超高濃度乙醇發(fā)酵的過程，酵母菌對高濃度乙醇的耐受性是提高發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度的重要前提，但是目前為止對影響酵母菌乙醇耐受性的因素還不夠深入。研究酵母菌乙醇耐性的分子機(jī)制，有助于揭示影響其耐受性的關(guān)鍵基因，并通過代謝工程操作定向提高酵母菌的乙醇耐受性，從而提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率[1]。

海藻糖對酵母菌在多種環(huán)境脅迫條件下的細(xì)胞活性具有保護(hù)作用，這些脅迫因素包括乙醇沖擊、熱沖擊、冷凍、氧化脅迫等[2-4]。與海藻糖合成相關(guān)的基因包括TPS1(海藻糖-6-磷酸合成酶)、TPS2(海藻糖-6-磷酸酶)和TSL1/TPS3(海藻糖-6-磷酸合成酶的調(diào)節(jié)亞基)，其中TPS1負(fù)責(zé)催化海藻糖合成的第一步反應(yīng)，對海藻糖的合成具有重要作用[5]。各國學(xué)者對于海藻糖在不同酵母中的抗逆境脅迫作用進(jìn)行了大量研究，得到的結(jié)論卻不完全一致，如對釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeXQ1的研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖在熱脅迫下明顯積累，但在乙醇和高滲脅迫下其含量沒有明顯變化[6]，而對酵母Saccharomycopsis fibuligera的研究表明，乙醇的脅迫對海藻糖的合成沒有影響[7]。近期有學(xué)者對S.cerevisiaeBY4742的研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖對致死乙醇濃度的脅迫有保護(hù)作用，而對半致死濃度的乙醇脅迫沒有作用[8]，這些研究結(jié)果提示了海藻糖對釀酒酵母的脅迫保護(hù)作用可能與菌種的遺傳背景和乙醇脅迫的程度有關(guān)。

利用啟動子構(gòu)建報(bào)告載體可通過報(bào)告基因的表達(dá)檢測外界環(huán)境對啟動子活性的影響。Karreman等構(gòu)建了GFP報(bào)告基因表達(dá)載體，利用熱擊蛋白基因Hsp12啟動子驅(qū)動GFP的表達(dá)，結(jié)果證明該啟動子可以響應(yīng)乙醇、高溫、高滲透壓等多種脅迫環(huán)境[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期對絮凝酵母乙醇耐性的生化機(jī)理研究表明，不同絮凝顆粒大小的絮凝酵母群體的海藻糖合成具有明顯差別，其乙醇耐受性也有所差別，提示了海藻糖的生物合成與乙醇耐受性的關(guān)系。本文通過構(gòu)建基于綠色熒光蛋白的報(bào)告載體進(jìn)一步研究了海藻糖合成酶基因TPS1在不同濃度乙醇脅迫條件下的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TPS1啟動子活性受一定乙醇濃度的誘導(dǎo)，進(jìn)一步證明了海藻糖的生物合成與絮凝酵母乙醇耐受性的關(guān)系，為深入研究絮凝酵母乙醇耐性的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微生物菌種和培養(yǎng)基

絮凝酵母Saccharomyces cerevisiaeflo以及釀酒酵母S.cerevisiaeATCC4126為本實(shí)驗(yàn)室保存。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 4，蛋白胨 3；

生長培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，酵母粉 4，蛋白胨 3。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母TPS1啟動子報(bào)告載體的構(gòu)建

pGEX-2T-EGFP質(zhì)粒(大連理工大學(xué)李文利老師惠贈)含有EGFP基因片段，利用BamH I/EcoR I雙酶切pYES2.0質(zhì)粒和pGEX-2T-EGFP質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒 pQZ01。按照參考文獻(xiàn)[10]中的方法提取絮凝酵母基因組 DNA作為模板，利用自行設(shè)計(jì)的引物TPS1-F(5′-GGAGGAACCGGT AGAGGACGGTTG CTGAA-3′)和 TPS1-R(5′-ATCGGTACC GATTGTC ACGGGAAGCC-3′)擴(kuò)增TPS1啟動子區(qū)，引物兩端分別引入AgeI和KpnI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物連接pQZ01，得到質(zhì)粒pQZ02。由于釀酒酵母ATCC4126不是URA缺陷型，因此將pQZ02中的URA基因用EcoR I和NotI切除，將來自pFA6A-KanMX4的抗性基因盒用同樣2種酶消化，得到質(zhì)粒pQZ03。該質(zhì)粒含有G418抗性基因用于酵母轉(zhuǎn)化子的選擇，并含有在TPS1啟動子引導(dǎo)下的EGFP基因，因此可通過檢測EGFP的表達(dá)來獲得TPS1啟動子對外界環(huán)境的響應(yīng)情況。

1.2.2 報(bào)告載體的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

報(bào)告載體利用電擊法轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母菌株S.cerevisiaeATCC4126，轉(zhuǎn)化子的篩選利用G418的抗性，濃度為300 μg/mL。將抗性平板上長出的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliXL1-Blue，將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，以自行設(shè)計(jì)的引物KanF(5′-ATGCGCGCGCGCGCCAGATCTGTTTA GC-3′)和KanR(5′-GCGAGCTCAGCTCGTTTTC GACACTGGA-3′)擴(kuò)增Kan抗性基因，并通過EcoR I和NotI雙酶切質(zhì)粒進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.3 報(bào)告載體轉(zhuǎn)化子的熒光檢測

熒光相對定量通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行(FACSCantoTM，美國DB公司)。挑取單個釀酒酵母4126轉(zhuǎn)化子，接種于5 mL含有100 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基中，160 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)24 h，取其中的200 μL接種于50 mL含有100 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至菌體進(jìn)入對數(shù)前期，OD600約為0.5。取4瓶44 mL的上述對數(shù)期細(xì)胞，分別向培養(yǎng)基中加入0、1、3.5、6 mL無水乙醇，為控制各實(shí)驗(yàn)組保持相同的體積，最后用無菌水補(bǔ)至總體積50 mL，得到乙醇終濃度分別為0(對照組)、2%、7%、12%的培養(yǎng)基，于160 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)，分別在 0、20、40、60、90、180、360、1 320 min取樣測其OD值，同時取樣1 mL，8 000 r/min離心2 min，用蒸餾水洗滌2次，最后將樣品稀釋至細(xì)胞濃度小于106/mL，利用流式細(xì)胞儀對GFP進(jìn)行熒光定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 絮凝酵母TPS1啟動子區(qū)的克隆和序列分析

利用釀酒酵母S288c的TPS1啟動子區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，以絮凝酵母的基因組序列為模板，擴(kuò)增出了預(yù)期大小的片段。對該擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，并與模式菌株 S288c的序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，絮凝酵母TPS1啟動子區(qū)除了有個別堿基存在差異，序列中部還多了一段21 bp的插入序列(圖1)，是一個新的啟動子，該啟動子序列已登錄 GenBank(登錄號FJ536256)。

圖1 絮凝酵母TPS1啟動子區(qū)(PTPS1-F)與S288cTPS1啟動子區(qū)(PTPS1-S288)差異序列的同源比對Fig.1 Alignment of the differential sequence of the promoter region ofTPS1from self-flocculating yeast and S288c.

2.2 報(bào)告載體對乙醇濃度的響應(yīng)

由于表達(dá)載體中，EGFP融合蛋白基因的表達(dá)由TPS1啟動子驅(qū)動，因此通過EGFP蛋白熒光強(qiáng)度來分析EGFP報(bào)告基因的表達(dá)水平，可以間接地反應(yīng)出TPS1啟動子的表達(dá)水平。利用7%和12%的乙醇沖擊后，在 7%乙醇的實(shí)驗(yàn)組中綠色熒光蛋白強(qiáng)度明顯提高(圖2A)，顯示了TPS1啟動子的活性在7%乙醇中明顯提高，而且其高活性從60 min開始到 1 320 min(22 h)逐漸提高(圖2A)。7%(V/V)乙醇脅迫時GFP熒光強(qiáng)度達(dá)到最高為11 036(A.U)，是無乙醇脅迫時GFP熒光強(qiáng)度的7.3倍。但是由于釀酒酵母抗乙醇脅迫的能力有限，因此隨著乙醇脅迫濃度的進(jìn)一步加大，即達(dá)到 12%(V/V)時，細(xì)胞開始死亡，無法啟動GFP基因的表達(dá)。本文也嘗試了用 2%(V/V)的乙醇脅迫酵母轉(zhuǎn)化子，但綠色熒光蛋白的表達(dá)與對照沒有明顯差別(數(shù)據(jù)未顯示)。

由于細(xì)胞的生長時期和生理狀態(tài)的不均一性，TPS1啟動子活性的誘導(dǎo)在細(xì)胞群體中的不同個體可能存在差異。添加 7%乙醇后，有熒光活性的細(xì)胞數(shù)(陽性率)也明顯提高(圖2B)，說明更多細(xì)胞表達(dá)了綠色熒光蛋白。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在無乙醇脅迫以及12%(V/V)乙醇脅迫時，GFP的表達(dá)量均很低，熒光顯微鏡下觀察到的熒光十分微弱，7%(V/V)脅迫后，GFP熒光強(qiáng)度很強(qiáng)(圖3)。以上結(jié)果可以充分說明，在乙醇脅迫處理?xiàng)l件下，酵母菌內(nèi)的TPS1啟動子的表達(dá)明顯強(qiáng)于未經(jīng)脅迫處理的酵母菌，且PTPS1spsc在一定程度上是受乙醇脅迫調(diào)控的誘導(dǎo)型啟動子。

圖2 絮凝酵母海藻糖合成酶啟動子在乙醇脅迫下的變化(A)和GFP陽性細(xì)胞占有率(B)Fig.2 Promoter activity ofTPS1in presence of different ethanol(A)and ratio of the cells expressing GFP after 180 min(B)under different ethanol concentrations.

圖3 不同乙醇濃度脅迫180 min時GFP表達(dá)情況的熒光顯微圖片F(xiàn)ig.3 Cells expressing GFP after ethanol shock treatment under fluorescence microscope.(A)Without ethanol.(B)With 7%(V/V)ethanol.(C)With 12%(V/V)ethanol.

由圖4可以看出，用 7%(V/V)或 12%(V/V)的乙醇脅迫轉(zhuǎn)基因酵母后，酵母的生長狀況與不用乙醇脅迫的對照組相比，酵母的生長受到抑制，添加7%(V/V)乙醇的實(shí)驗(yàn)組在180 min后開始生長，但直到1 320 min，生長速度明顯慢于對照組。添加12%(V/V)乙醇的實(shí)驗(yàn)組酵母始終沒有越過停滯期，可見這 2個濃度的乙醇都對酵母起到了較強(qiáng)的脅迫抑制作用(圖3)。另外，活性酵母細(xì)胞不容易被亞甲基蘭染色，顯微鏡下觀察到的酵母細(xì)胞較為透明，而死亡的酵母細(xì)胞容易被亞甲基蘭染成紫色，亞甲基蘭染色結(jié)果再次證明了 7%(V/V)和 12%(V/V)的乙醇都對酵母細(xì)胞起到了較強(qiáng)的脅迫作用，其中采用12%(V/V)的乙醇脅迫過度，導(dǎo)致大量酵母細(xì)胞死亡(結(jié)果未顯示)。7%(V/V)的乙醇誘導(dǎo)了TPS1啟動子大量啟動EGFP的表達(dá)。

圖4 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化子在不同濃度乙醇脅迫下的生長情況Fig.4 Cell growth of the yeast transformants in presence of different concentration of ethanol.

本實(shí)驗(yàn)室前期對絮凝酵母乙醇耐性的生物化學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，絮凝酵母的乙醇耐性與細(xì)胞內(nèi)的海藻糖含量相關(guān)[11-12]，海藻糖也是酵母細(xì)胞在環(huán)境脅迫條件下積累的胞內(nèi)產(chǎn)物，而海藻糖合成酶 TPS1是酵母海藻糖合成的關(guān)鍵酶，因此TPS1基因啟動子的活性強(qiáng)弱可以反映TPS1基因的表達(dá)情況，進(jìn)而反映海藻糖合成酶的表達(dá)量和海藻糖在酵母細(xì)胞內(nèi)的合成情況。以上研究結(jié)果揭示了PTPS1spsc在乙醇脅迫下表達(dá)明顯提高，證明了乙醇可在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)海藻糖的合成。

本實(shí)驗(yàn)室前期對絮凝酵母乙醇耐性的生化機(jī)理研究表明，乙醇耐性不同的絮凝顆粒群體的海藻糖合成情況具有明顯差別[11-12]，但是對海藻糖的合成與乙醇耐性的直接關(guān)系還不清楚。本文的結(jié)果表明，在一定濃度乙醇存在下，絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1的啟動子活性被迅速誘導(dǎo)，進(jìn)而啟動海藻糖的合成，因此絮凝酵母海藻糖的生物合成與乙醇耐受性具有密切的關(guān)系。本文發(fā)現(xiàn)TPS1的啟動子活性在亞致死乙醇濃度下最高，顯示了細(xì)胞通過啟動海藻糖的合成有效保護(hù)其免受乙醇的毒害。文獻(xiàn)報(bào)道利用熱擊蛋白Hsp12啟動子驅(qū)動GFP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該啟動子可以響應(yīng)乙醇、高溫、高滲透壓等多種脅迫[9]，而本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示，絮凝酵母的TPS1基因啟動子活性只對乙醇有響應(yīng)，對高溫和高糖條件沒有明顯響應(yīng)，而且文獻(xiàn)報(bào)道Hsp12啟動子作用時間較短，80 min時GFP的表達(dá)量開始下降，這與本文所研究的啟動子PTPS1spsc啟動EGFP表達(dá)的持續(xù)時間較長，短時間內(nèi) EGFP的表達(dá)量無下降趨勢具有明顯不同，說明不同的乙醇脅迫相關(guān)基因的作用具有明顯差異，能在不同時間啟動相關(guān)代謝反應(yīng)機(jī)制和細(xì)胞的相關(guān)防御反應(yīng)。進(jìn)一步的研究將揭示絮凝酵母海藻糖合成酶基因在超高濃度乙醇發(fā)酵過程中的表達(dá)量變化，并利用所建立的報(bào)告載體系統(tǒng)進(jìn)一步研究絮凝酵母基因組內(nèi)其他基因?qū)ζ湟掖寄托缘挠绊懀钊虢沂拘跄湍敢掖寄托缘姆肿訖C(jī)制，為選育耐受高濃度乙醇的菌株提供理論基礎(chǔ)。

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Cloning of the promoter region of the Trehalose-6-phosphate synthase gene TPS1 of the self-flocculating yeast and exploration of the promoter activity on ethanol stress

Bei Lin1,2, Xinqing Zhao1, Qiumei Zhang1, Liming Ma1, and Fengwu Bai1
1 Department of Life Science and Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China 2 Department of Polytechnic, North College of Beijing University of Chemical Technology, Langfang 065201, China

Received:May 26, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:Natural Science Foundation of China(No.30500011), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA10Z358).

Corresponding author:Xinqing Zhao.Tel: +86-411-84707617; E-mail: xqzhao@dlut.edu.cn國家自然科學(xué)基金(No.30500011)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2007AA10Z358)資助。